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作者：周载鑫中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究目的肝癌是一种致死率极高的恶性肿瘤疾病,我国每年约有40万新发病例,有超过34万例肝癌患者死亡,占全球总发病人数和总死亡人数50%以上。我国肝癌患者确诊时大多处于中晚期,多数伴有门静脉癌栓(Portal vein tumor thrombosis,PVTT)... 详细信息

研究目的肝癌是一种致死率极高的恶性肿瘤疾病,我国每年约有40万新发病例,有超过34万例肝癌患者死亡,占全球总发病人数和总死亡人数50%以上。我国肝癌患者确诊时大多处于中晚期,多数伴有门静脉癌栓(Portal vein tumor thrombosis,PVTT),预后较差。PVTT是影响肝癌患者预后的重要风险因素。研究报道伴有PVTT患者的总体生存期较无PVTT的患者明显缩短,五年生存率不足20%。目前肝癌合并PVTT的治疗除手术介入治疗外,尚无其他显著有效的治疗手段。肝癌异质性较强,肿瘤组织成分复杂,PVTT发生机制及克隆起源不明是疗效不佳的原因之一。有研究报道PVTT的发生与肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)和肿瘤微环境密切相关。我们的早期研究发现ICR和miR135a等非编码RNA可以与其靶基因结合促进肿瘤细胞发生转移,增强肝癌肿瘤干细胞自我更新能力,促进PVTT的发生。14-3-3-ζ等蛋白通过缺氧肿瘤微环境抑制HIF-1α降解,增强肿瘤组织中上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),促进PVTT的发生,提示肝癌细胞转移能够诱导PVTT的发生。然而研究过程中,我们发现有一些小肝癌患者或者未见肝内原发灶的患者也有PVTT的发生,这些PVTT的来源与发生机制尚不清楚。本研究的主要目的:1)揭示不同起源PVTT与其对应原发灶肝癌组织的克隆起源差异;2)阐明不同起源的PVTT独特的分子表达特征;3)寻找鉴别PVTT-原发灶克隆起源相似性差异的判别基因集,为PVTT特异性治疗方法的研究提供一定的帮助。研究方法针对本课题的研究目的采用以下研究方法:1.采用DNA拷贝数变异(Copy number variations,CNV)芯片(Affymetrix CytoscanHD)检测肝癌患者来源PVTT及肝癌组织拷贝数变异情况。利用R语言affy2sv包,采用GISTIC(GISTC2.0)的算法在染色体水平分析同一患者来源PVTT和肝癌组织染色体结构异常是否一致。并在基因水平上,分析肿瘤发生相关基因突变及其表达情况对组织起源进行进一步确认。另外,根据组织基因表达谱,对PVTT及对应的肝癌组织进行分子分型分析,确认PVTT及肝癌组织所属的组织亚型。2.利用PVTT及对应肝癌组织的表达谱测序(RNA-seq)数据,采用EBSeq进行差异表达分析检测不同起源的PVTT及对应肝癌组织特异表达谱,并进一步采用GO和KEGG pathway富集分析方法检测PVTT及肝癌组织的特异的生物学过程和信号通路,探讨不同起源PVTT发生的特征性分子表达谱。3.利用PVTT及对应肝癌组织的表达谱测序(RNA-seq)数据,采用ssGSEA分析方法分析肝组织中胆管细胞、成熟肝细胞、肝前体细胞及肝星状细胞标记基因集在PVTT及肝癌组织的富集程度,探讨PVTT潜在的起源细胞类型。并采用相同的方法分析造血干细胞及肝癌干细胞相关基因集在PVTT及肝癌组织中的富集程度,探讨造血干细胞及肝癌干细胞在门静脉癌栓发生中的作用。4.利用PVTT及对应肝癌组织的表达谱测序(RNA-seq)数据,在基因差异表达分析的基础上,构建基因互作网络并寻找核心位置的基因集。采用qPCR和聚类分析方法检测核心基因集在判断PVTT起源方面的应用潜能,探索性地寻找能够诊断PVTT的基因集。5.用PVTT及对应肝癌组织的表达谱测序(RNA-seq)数据,采用ssGSEA方法分析免疫细胞相关基因集在各PVTT及肝癌组织中的富集程度,检测PVTT中免疫细胞侵润情况。并进一步采用Nearest Template Prediction(NTP)方法分析PVTT及肝癌组织所属的免疫反应亚型,探讨免疫疗法在治疗肝癌PVTT中的应用潜能。研究结果CNV相似性分析发现19例患者中,18例患者来源PVTT和对应肝癌组织的相似性比值(likelihood ratio 2,LR2)较大(>10,P0.05)。染色体水平分析发现,PVTT13与T13之间存在明显不一致的染色体结构异常。在PVTT13中发生缺失的区段如2q24.1-2q31.1在T13中则发生扩增,在PVTT13中发生扩增的区段如5q13.2-5q35.2及15q11.2-15q21.1在T13中则发生缺失。在除P13患者之外的其余18例患者中则没有这种现象。CNV基因水平分析发现,10个肝癌相关驱动基因的突变情况在PVTT13与T13之间也存在较大差异。如ADCY2在PVTT13中拷贝数(Copy Number=5)明显高于T13中的拷贝数(Copy Number=2);CTNNB1在PVTT13中拷贝数(Copy Number

关键词：肝癌 PVTT 克隆起源分子表达特征

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电穿孔法转染人原代成纤维细胞条件的优化

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第二军医大学学报 2017年第10期38卷 1311-1314页

作者：张放周载鑫张丹丹房贺刘善荣第二军医大学长海医院实验诊断科解放军东部战区73901部队第二军医大学长海医院临床实验中心第二军医大学长海医院烧伤科

目的通过优化电穿孔转染条件,探讨影响人原代成纤维细胞电转染效率和转染后细胞存活率的因素,筛选出人原代成纤维细胞的最佳电转染条件。方法通过改变脉冲电压、脉冲次数和质粒浓度等条件,将含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGF... 详细信息

目的通过优化电穿孔转染条件,探讨影响人原代成纤维细胞电转染效率和转染后细胞存活率的因素,筛选出人原代成纤维细胞的最佳电转染条件。方法通过改变脉冲电压、脉冲次数和质粒浓度等条件,将含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGFP-N1电穿孔转染入人原代成纤维细胞。利用锥虫蓝染色检测细胞存活情况,采用流式细胞术检测转染24h后的转染效率。结果在低电压模式下,脉冲电压320V、质粒浓度为20μg/mL、脉冲1次时,人原代成纤维细胞的电转染效果最理想,转染效率达到(42.53±0.63)%,细胞存活率为(74.30±3.01)%。结论优化了人原代成纤维细胞的电转染条件,在保证细胞较高存活率的前提下提高了人原代成纤维细胞的电转染效率,为后续基因功能的研究打下基础。

关键词：电穿孔成纤维细胞细胞存活转染效率脉冲

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16例冷凝集素造成的血型不合分析

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中国输血杂志 2021年第1期34卷 40-43页

作者：谢惠益周载鑫顾海慧钱宝华海军军医大学第一附属长海医院输血科上海200433

目的探讨冷凝集素对血型造成的影响及相应的处理效果。方法采用37℃水浴、吸收放散试验及2-巯基乙醇等方法消除冷凝集素的影响,并对处理后的红细胞和血清进行正反定型、交叉配血、直接抗人球蛋白实验及间接抗人球蛋白实验等实验。结果 1... 详细信息

目的探讨冷凝集素对血型造成的影响及相应的处理效果。方法采用37℃水浴、吸收放散试验及2-巯基乙醇等方法消除冷凝集素的影响,并对处理后的红细胞和血清进行正反定型、交叉配血、直接抗人球蛋白实验及间接抗人球蛋白实验等实验。结果 16例患者标本在处理前均呈明显的正反定型不符,交叉配血困难,经鉴定均由冷凝集素造成。经过相应处理后,所有标本正反定型、交叉配血及抗体筛选均相符或呈阴性,患者输注交叉配血相合血液成分均未发生输血反应,血红蛋白上升符合输注有效标准。结论对于明确由冷凝集素引起的正反定型不符或交叉配血不合的标本,经过37℃水浴、吸收放散试验及2-巯基乙醇处理后,可以消除冷凝集素带来的干扰,获得正确的实验结果,其中AIHA的病人表现出的不同于其他病例的冷凝集素的强反应性更值得我们的关注。

关键词：冷凝集素自身免疫性溶血性贫血正反定型不符交叉配血抗体筛选

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低离子凝聚胺开展交叉配血试验在输血检验中的应用效果分析

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中外医疗 2020年第35期39卷 179-181页

作者：郭菲周载鑫祝丽双钱宝华上海长海医院输血科上海200433

目的分析凝聚胺介质交叉配血试验在输血检验中的应用效果。方法便利抽选2019年1月—2020年1月在该院输血治疗的74例患者,以双盲法划入参照组(n=37)与研究组(n=37)。交叉配血试验中,参照组使用常规盐水介质法,研究组使用低离子凝聚胺技术... 详细信息

目的分析凝聚胺介质交叉配血试验在输血检验中的应用效果。方法便利抽选2019年1月—2020年1月在该院输血治疗的74例患者,以双盲法划入参照组(n=37)与研究组(n=37)。交叉配血试验中,参照组使用常规盐水介质法,研究组使用低离子凝聚胺技术,比较不规则抗体和假阳性率。结果研究组交叉配血试验的时间均值是(3.42±1.31)min,参照组交叉配血试验的时间均值是(6.94±1.27)min,相较而言研究组的交叉配血试验检测时间较短,与参照组对比差异有统计学意义(t=5.940,P<0.05)。研究组患者检测的阳性率、灵敏度、准确度均高于参照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论输血检验中以低离子凝聚胺介质开展交叉配血试验,能够缩短试验的时间,且阳性检出率、准确率均相对较高,操作方式简单、快捷,能够为临床输血安全提供可靠依据。

关键词：低离子凝聚胺交叉配血试验输血检验

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一例血浆置换在马凡综合征患者术后并发血栓性血小板减少性紫癜治疗中的应用

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临床输血与检验 2021年第2期23卷 242-245页

作者：冯子阳查占山周载鑫唐河山余咏潮钱宝华海军军医大学第一附属医院输血科上海200433 海军军医大学第一附属医院心血管外科上海200433

目的探讨血浆置换(PE)在治疗马凡综合征(MFS)患者术后并发血栓性血小板减少性紫癜(TTP)中的有效性与安全性。方法术后第7天开始进行PE,隔日1次,共置换3次。于置换前后监测血小板(PLT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBil)、肌酐(Cr)、尿素... 详细信息

目的探讨血浆置换(PE)在治疗马凡综合征(MFS)患者术后并发血栓性血小板减少性紫癜(TTP)中的有效性与安全性。方法术后第7天开始进行PE,隔日1次,共置换3次。于置换前后监测血小板(PLT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBil)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)以及血管性血友病因子抗原(von Willebrand factor antigen,vWF:Ag)和血友病因子裂解酶(von willebrand factor cleaving protease,ADAMTS13)抗体共7个指标,并监测治疗过程中凝血象(PT、TT、APTT)的变化。结果经过3次PE治疗后,患者的LDH、TBil、vWF:Ag和ADAMTS13抗体均显著下降;PLT计数迅速恢复至正常水平;Cr和BUN总体下降并接近正常范围;凝血指标在血浆置换过程中监测平稳。结论PE治疗MFS患者术后并发TTP安全有效,早期诊断并及时行PE治疗可改善患者预后。

关键词：血浆置换马凡综合征血栓性血小板减少性紫癜血友病因子裂解酶抗体

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两种血袋白膜法制备浓缩血小板质量研究

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实用临床医药杂志 2020年第22期24卷 87-89,92页

作者：余凤秀周载鑫沈秋朱燕霞钱宝华上海长海医院输血科上海200433

目的比较顶底袋与四联袋白膜法制备浓缩血小板的质量差异。方法采集40个400 mL ACD抗凝全血,摇匀后静置1 h,均分至顶底袋和四联袋中,每袋200 mL。以顶底袋为实验组,四联袋为对照组,应用G5血细胞分离机制备浓缩血小板。结果实验组中血小... 详细信息

目的比较顶底袋与四联袋白膜法制备浓缩血小板的质量差异。方法采集40个400 mL ACD抗凝全血,摇匀后静置1 h,均分至顶底袋和四联袋中,每袋200 mL。以顶底袋为实验组,四联袋为对照组,应用G5血细胞分离机制备浓缩血小板。结果实验组中血小板为(986.0±277.0)×10^9/L,对照组中血小板为(705.0±322.0)×10^9/L,差异有统计学意义(P 0.05)。结论顶底袋制备浓缩血小板数量与质量以及红细胞回收率均优于四联袋。

关键词：浓缩血小板顶底袋白膜制备法血液质量

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抗-M抗体影响血型鉴定及对临床输血的影响

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临床输血与检验 2022年第6期24卷 716-720页

作者：谢惠益周载鑫杨玥王星怡李津杞牟显尧顾海慧钱宝华海军军医大学第一附属医院上海200433

目的通过探讨抗-M抗体对血型鉴定造成的干扰,分析提前发现此类抗体对输血相容性检测和临床输血的必要性,进而探讨O型红细胞在日常不规则抗体筛查中的重要性。方法收集2019年1月~2021年12月在我院输血科首次进行血型鉴定,其中18例反定型... 详细信息

目的通过探讨抗-M抗体对血型鉴定造成的干扰,分析提前发现此类抗体对输血相容性检测和临床输血的必要性,进而探讨O型红细胞在日常不规则抗体筛查中的重要性。方法收集2019年1月~2021年12月在我院输血科首次进行血型鉴定,其中18例反定型鉴定中O型红细胞对照管为凝集最终确定为抗-M抗体影响血型的标本,通过抗人球蛋白实验等方法进行抗体鉴定,用吸收放散试验及2-巯基乙醇等方法消除不规则抗体的影响,并对处理后的红细胞和血清进行正反定型确认实验,通过盐水法、凝聚胺法和卡式抗人球法进行交叉配血实验。结果这18例O型红细胞对照管为凝集的标本中,16例正反定型不符;2例O型标本全自动血型仪正反定型相合,但试管法复核反定型时发现O型红细胞对照管凝集,自身对照管阴性,提示存在ABO系统以外的不规则抗体。所有标本经抗体鉴定均检出抗-M抗体,在37℃或抗球蛋白阶段能发生反应的IgM+IgG抗体有11例,14例进行了交叉配血实验,其中4例患者输注了悬浮红细胞等血液成分,无一例发生输血不良反应。输血后疗效评价发现输注有效。结论对于明确由抗-M类不规则抗体引起的正反定型不符或交叉配血不合的标本,血清经过吸收试验及2-巯基乙醇处理,可以消除不规则抗体带来的干扰,获得正确的实验结果,而在使用全自动血型仪鉴定血型中加入O型红细胞对照管则能提高抗-M类的冷反应性的盐水抗体的检测率。

关键词：抗-M抗体 ABO血型鉴定正反定型不符交叉配血试验输血安全

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2009-2018年单采血小板捐献者保留的策略分析

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中国输血杂志 2019年第9期32卷 940-942页

作者：葛立华周载鑫顾海慧程小林余凤秀钱宝华海军军医大学长海医院输血科

目的通过分析上海某血站单采血小板无偿献血情况,探讨保留单采血小板捐献者的策略,为进一步加强单采血小板献血志愿者的保留工作提供依据。方法采取问卷调查和电话回访等方法,回顾性总结2009-2018年上海某血站的血小板单采工作状况,比... 详细信息

目的通过分析上海某血站单采血小板无偿献血情况,探讨保留单采血小板捐献者的策略,为进一步加强单采血小板献血志愿者的保留工作提供依据。方法采取问卷调查和电话回访等方法,回顾性总结2009-2018年上海某血站的血小板单采工作状况,比较无偿献血者的性别、动机、采血者服务等对献血者献血意愿和再次献血行为影响的相关性,分析对固定献血者保留的相关影响因素。结果固定献血人群中女性比例较高,医护人员良好的服务是促进固定献血者保留的重要因素,献血者时间和地点的改变是影响成分献血的主要因素,提高献血者对自我价值的实现是有效的再招募手段。结论通过献血宣传、精准服务以及后期交流等方式可以提高对血小板固定献血者的保留。

关键词：无偿献血单采血小板志愿者保留

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二次重度离心制备法对冷沉淀凝血因子质量的影响

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临床输血与检验 2020年第5期22卷 477-480页

作者：余凤秀李津杞朱燕霞郭菲周载鑫顾海慧钱宝华上海长海医院输血科 200433

目的探讨一次或二次重度离心制备新鲜冰冻血浆(冷沉淀凝血因子原料浆)对冷沉淀凝血因子质量的影响。方法检测冷沉淀凝血因子中游离血红蛋白含量、Ⅷ因子和纤维蛋白原含量。全血40单位(每单位200 mL)分成对照组、实验组,每组n=20。按国... 详细信息

目的探讨一次或二次重度离心制备新鲜冰冻血浆(冷沉淀凝血因子原料浆)对冷沉淀凝血因子质量的影响。方法检测冷沉淀凝血因子中游离血红蛋白含量、Ⅷ因子和纤维蛋白原含量。全血40单位(每单位200 mL)分成对照组、实验组,每组n=20。按国家标准采集、离心和分离,再将实验组新鲜冰冻血浆(冷沉淀凝血因子原料浆)进行第二次离心和分离,同时放入-80℃深低温冰箱速冻,储存时间为14天。14天后经过离心法制备成冷沉淀凝血因子,分别进行残留血红蛋白、Ⅷ因子和纤维蛋白原含量的检测。结果实验组残留血红蛋白含量(17.64±5.60)mg/L,显著低于对照组(25.75±9.78)mg/L(t=0.035,P0.05)。结论二次重度离心新鲜冰冻血浆(冷沉淀凝血因子原料浆)能使残留红细胞更少,使残留游离血红蛋白更低,可以提高冷沉淀凝血因子中Ⅷ因子的含量,从而提高冷沉淀凝血因子制备质量。

关键词：新鲜冰冻血浆冷沉淀凝血因子游离血红蛋白 Ⅷ因子纤维蛋白原

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口服特比萘芬对HIV患者肠道屏障影响的探索性研究

口服特比萘芬对HIV患者肠道屏障影响的探索性研究

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作者：周鑫西南大学

学位级别：硕士

人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染/艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)疫情形势依然严峻。尽管大多数患者通过抗逆转录病毒治疗(Antiretroviral therapy,ART)免疫功能得以重建,但病毒仍不能完全清除。由于肠道淋巴组织丰富,HIV进入细胞所需辅助受体——趋化因子受体5(C-C chemokine receptor 5,CCR5)在肠道呈高表达,因此肠道是HIV病毒优先靶标和复制的主要部位。HIV患者肠道屏障长期处于受损状态,通透性增加,肠道微生物及代谢产物移位进入循环系统,促进异常免疫激活,进而导致癌症等AIDS并发症风险显著增加,因此肠道屏障功能受损和微生物移位已成为HIV患者ART时代面临的主要问题之一。此外,肠道菌群紊乱(包括细菌、真菌、病毒、古生菌等)与HIV疾病进展和患者临床结局密切相关,其中细菌菌群和真菌菌群在肠道菌群中占据绝大部分,二者相互作用,密切相关,共同维持肠道的生态平衡。真菌作为机体菌群生态系统的重要组成,对肠道屏障功能产生显著影响。而真菌感染是HIV患者最常见的机会性感染,抗真菌药物作为一线治疗方案在临床广泛应用,但该类药物(尤其是口服抗真菌药物)是否通过影响真菌菌群,进而影响HIV患者肠道屏障功能和微生物移位目前尚不清楚,不利于抗真菌治疗方案的制定和优化。鉴于此,本研究以病情稳定,无重大干扰因素且口服特比萘芬治疗甲真菌病的HIV患者为研究对象,采取单臂纵向队列研究设计,收集20名患者用药前后和停药前后(即基线、治疗后第1-2周、第12周、停药后12周四个随访点)血浆、粪便样本和临床资料,研究口服特比萘芬治疗对肠道屏障功能(肠道损伤,微生物移位,炎症因子和肠道菌群)的影响以及与临床转归的相关性,为临床合理应用抗真菌药物提供科学依据。现将研究内容和结果汇报如下:1.口服特比萘芬对HIV合并甲真菌病患者肠道屏障的影响我们收集了20名HIV合并慢性真菌感染患者四个随访点的血浆和粪便样本。采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定血浆样品中肠道脂肪酸结合蛋白(Intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)和再生胰岛衍生蛋白3α(Regenerating islet derived protein 3 alpha,REG3α)浓度分析肠道损伤程度,结果显示肠道损伤标志物I-FABP在服药过程中浓度显著上升(P=0.021,0.044),停药后恢复至服药前水平,提示特比萘芬可能对肠道屏障有一定的损伤作用。REG3α在四个随访点间无统计学差异。采用ELISA法和鲎变形细胞溶解物(Limulus amebocyte lysate,LAL)试验测定血浆样品中脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)和(1,3)-β-D-葡聚糖((1,3)-β-D-Glucan,BDG)浓度分析肠道微生物移位情况,结果显示微生物移位标志物LPS和BDG在四个随访点间无统计学差异。采用ELISA法测定血浆样品中白介素(Interleukin,IL)-6、IL-10、可溶性CD14(Soluble CD14,s CD14)、肿瘤坏死因子α(Tumour necrosis factor alpha,TNF-α)浓度来分析机体炎症因子水平,发现炎症因子IL-6在服药1周后减少(P=0.048),随后恢复正常,IL-10、s CD14和TNF-α浓度在四个随访点均无统计学差异。采用q PCR测定粪便中细菌、真菌DNA总量相对变化,发现口服特比萘芬前后受试者肠道粪便细菌DNA总量没有明显变化,真菌DNA总量在服药期间逐渐下降,服药第1周与第12周两组之间存在统计学差异(P=0.022)。采用16S r DNA和ITS1(Internal transcribed spacer 1)高通量测序分析肠道粪便细菌和真菌多样性及群落组成差异,结果显示口服特比萘芬前后受试者肠道菌群的Alpha多样性和Beta多样性未见明显区别,物种组成分析显示服药第12周,细菌菌群中有益菌哈利优杆菌(Eubacterium hallii)、毛螺旋菌(Lachnospira)、阿克曼氏菌(Akkemmansia)丰度上升,有害菌弯曲杆菌(Campylobacter)和琥珀酸弧菌(Succinivibrio)丰度下降;真菌菌群中念珠菌(Candida)丰度下降。采用Spearman相关性分析分析肠道菌群与肠道损伤标志物、微生物移位标志物、炎症因子水平的相关性,发现肠道细菌和真菌菌群中有多个菌属与这些标志物呈正相关或负相关。2.口服特比萘芬对HIV合并甲真菌病患者临床转归的影响我们统计分析了受试者的临床疗效数据,分析口服特比萘芬对HI

关键词：肠道屏障艾滋病毒(HIV) 抗真菌药物肠道菌群移位

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