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猪流行性腹泻研究概况

动物医学进展 2018年第7期39卷 102-107页

作者：周宏专北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京100097

猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪流行性腹泻(PED)在世界范围内广泛存在。近年来,由于病毒变异造成的病毒毒力增强,给许多国家的养猪业造成了极大的经济损失,受到兽医研究人员的广泛关注。研究人员针对毒株的变异、致病机理、病毒实验室... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪流行性腹泻(PED)在世界范围内广泛存在。近年来,由于病毒变异造成的病毒毒力增强,给许多国家的养猪业造成了极大的经济损失,受到兽医研究人员的广泛关注。研究人员针对毒株的变异、致病机理、病毒实验室诊断和新型疫苗的研究等方面开展了积极研究,如诊断方法中的荧光微球免疫法和荧光聚焦中和法,以及以马脑炎病毒基因为载体的PEDV颗粒疫苗的制备研究等。这些研究使得人们对猪流行性腹泻病毒致病机理解更加深入。论文基于国内外的相关研究进展,就猪流行性腹泻的病原起源、流行现状、病原学、病毒检测方法和防控等进行综述,以期为该病的预防和控制提供参考。

关键词：猪流行性腹泻病毒流行病学致病机理检测方法疫苗

携带PRRS病毒ORF5基因胸膜肺炎放线杆菌载体的构建及特性鉴定

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携带PRRS病毒ORF5基因胸膜肺炎放线杆菌载体的构建及特性鉴定

作者：周宏专首都师范大学

学位级别：硕士

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的呼吸道病原细菌;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)可引起一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的烈性传染病。这两种病原均为当前公认的危害现代养猪业的重大传染性病原。本文在APP基... 详细信息

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的呼吸道病原细菌;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)可引起一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的烈性传染病。这两种病原均为当前公认的危害现代养猪业的重大传染性病原。本文在APP基因缺失突变致弱菌株构建成功的基础上，将PRRSV基因组中编码保护性抗原的ORF5基因片段插入APP基因缺失区，构建携带异源基因的APP细菌载体。本试验结果将为研制可同时预防APP和PRRSV这两种病原感染的细菌减毒活疫苗奠定坚实的基础。首先利用原核表达系统对PRRSV-ORF5基因片段进行表达分析以鉴定可在细菌中表达的抗原表位。利用PCR方法分别扩增ORF5基因缺失信号肽的D片段、缺失信号肽和跨膜区的L片段、缺失信号肽的5’端N片段和缺失跨膜区的3’端C片段，经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达，结果显示未缺失跨膜区的D片段未见表达产物，而L片段、N片段和C片段分别表达大小约为33 kDa、25 kDa和29 kDa的融合蛋白。Western blotting检测结果显示L片段表达蛋白可与PRRSV阳性血清发生结合反应，C片段反应性稍弱，而N片段未出现阳性反应。结果证实含有跨膜区的ORF5基因片段不能良好表达，C端在与GP5抗体结合方面具有重要作用。在ORF5基因不同功能区表达分析的基础上将ORF5基因片段(L)分别插入apxIA或apxIC基因缺失区以构建不同的突变菌株。利用双酶切分别自重组质粒pTAU、pT-ORF5L、pTChl和pTAD中切出1.8 kb的AU、348 bp的ORF5L、1.1 kb的Chl和1.7 kb的AD基因片段，将上述基因片段串联并插入pUC19的相应酶切位点，构建转移载体pUIA-L-Chl。用同样的方法分别自重组质粒pTCU、pT-ORF5L、pTChl和pTCL中切出2.2 kb的CU、348 bp的ORF5L、1.1 kb的Chl和1.8 kb的CL基因片段，将上述基因片段串联并插入pUC19的相应酶切位点，构建转移载体pUIC-L-Chl。将两种转移载体经电转化分别导入胸膜肺炎放线杆菌血清10型野生菌株中进行同源重组，筛选获得两种突变菌株。利用PCR和Southern Blotting对突变菌株进行了鉴定，并对突变菌株生物学特性进行了分析。结果表明，ORF5基因片段已成功导入突变菌株中，两种突变菌株均可正常增殖，连续传代后插入的Chl和ORF5基因片段可稳定遗传，与母源菌株相比毒力降低100倍以上，将突变菌株免疫小鼠后利用ELISA检测小鼠血清中GP5抗体水平，证实随免疫次数增加GP5抗体呈现逐步升高的趋势，提示突变菌株中携带的ORF5基因片段具有表达能力，同时ELISA检测结果显示apxIA基因缺失突变菌株的GP5抗体水平明显高于apxIC基因缺失突变菌株GP5抗体水平。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌细菌载体猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因突变同源重组

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猪博卡病毒研究概述

动物医学进展 2014年第8期35卷 103-107页

作者：周宏专北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京100097 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所矿物元素营养研究室北京100193

2009年瑞典学者在患断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪体内首次检测到猪博卡病毒,近年来对该病毒的研究已从分子病原学向流行病学、致病性等逐渐深入,对揭示该病原的致病机理将具有重要意义。论文基于国内外的相关研究,对该病毒的发现、基... 详细信息

2009年瑞典学者在患断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪体内首次检测到猪博卡病毒,近年来对该病毒的研究已从分子病原学向流行病学、致病性等逐渐深入,对揭示该病原的致病机理将具有重要意义。论文基于国内外的相关研究,对该病毒的发现、基因组结构特征、病毒分型、流行现状及检测诊断方法等方面进行概述。

关键词：猪博卡病毒基因组结构流行病学检测

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家禽产品和公共卫生—一项关键性的调查

中国家禽 2007年第18期29卷 1-5页

作者： Lüppo Ellerbroek 周宏专德国联邦风险评估研究所　

近年来人类的食源性疫病事件在世界范围内大大增加。如何有效监管和控制这些疫病成为目前各界人士关注的重点。作者对家禽生产和加工的每一个环节的卫生控制进行了详细阐述,并指出基于风险评估的食品卫生立法是大势所趋。

关键词：肉品检验弯曲杆菌食品检验沙门氏菌病原微生物致病微生物人畜共患病食品动物活体家禽屠宰家禽饲养鸡群家禽产品

基因芯片和ELISA检测临床样品中禽白血病的比较研究

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黑龙江畜牧兽医 2016年第6期 169-171,286页

作者：朱瑞豪苏霞周宏专赵坤杨兵河南科技学院动物科学学院河南新乡453003 北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京100097

为了鉴定实验室建立的禽白血病基因芯片检测方法与商品化ELISA方法的符合情况,试验从北京市某种鸡场挑选疑似禽白血病的蛋鸡13只,分别采集蛋清、血清、全血及泄殖腔棉拭子样品,利用基因芯片方法和商品化ELISA试剂盒进行检测比较。结果表... 详细信息

为了鉴定实验室建立的禽白血病基因芯片检测方法与商品化ELISA方法的符合情况,试验从北京市某种鸡场挑选疑似禽白血病的蛋鸡13只,分别采集蛋清、血清、全血及泄殖腔棉拭子样品,利用基因芯片方法和商品化ELISA试剂盒进行检测比较。结果表明:基因芯片方法检测全血和泄殖腔棉拭子的阳性率均为69.23%;ELISA试剂盒检测蛋清和泄殖腔棉拭子样品中p27抗原的阳性率为23.08%。说明利用基因芯片方法检测全血和泄殖腔棉拭子样品的阳性检出率较高。

关键词：禽白血病病毒基因芯片全血蛋清泄殖腔棉拭子 ELISA 符合率

犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒三重PCR检测方法的建立

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畜牧与兽医 2018年第7期50卷 103-107页

作者：苏霞周宏专常彦嫣杨兵北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）和犬冠状病毒（CCV）的基因序列保守片段分别设计特异性引物,建立了可以同时检测CDV（684 bp）、CPV（213 bp）和CCV（417 bp）的三重PCR方法。特异性结果表明,所建立的体系... 详细信息

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）和犬冠状病毒（CCV）的基因序列保守片段分别设计特异性引物,建立了可以同时检测CDV（684 bp）、CPV（213 bp）和CCV（417 bp）的三重PCR方法。特异性结果表明,所建立的体系只能扩增CDV、CPV、CCV,而不能扩增犬腺病毒Ⅱ型（CAV-Ⅱ）和犬副流感病毒（CPIV）;敏感性试验表明,该方法对CDV、CPV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10^- 2、6.0×10^-2和6.7×10^-2 copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。采用建立的三重PCR方法对北京、山东地区收集的临床粪便样品进行检测结果表明,使用三重PCR体系的扩增结果与单项PCR扩增结果一致,符合率为100%。以上结果表明该方法快速、敏感、特异性强,对上述3种病毒能够进行快速鉴定诊断,为临床诊断提供了快速简便的方法。

关键词：犬瘟热病毒犬细小病毒犬冠状病毒三重PCR

表达空肠弯曲菌CfrA蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其免疫效果

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微生物学报 2016年第8期56卷 1326-1334页

作者：王传文周宏专郭芳芳陈玉霞杨兵苏霞朱瑞良徐福洲山东农业大学动物科技学院山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室山东泰安271018 北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京100097

【目的】本试验将空肠弯曲菌肠菌素受体蛋白CfrA编码基因导入食品级乳酸乳球菌表达系统,然后将重组乳酸乳球菌口服免疫鸡,降低空肠弯曲菌在鸡肠道中的定殖。【方法】利用PCR分别扩增空肠弯曲菌cfrA全基因及其N端片段,插入食品级表达载体... 详细信息

【目的】本试验将空肠弯曲菌肠菌素受体蛋白CfrA编码基因导入食品级乳酸乳球菌表达系统,然后将重组乳酸乳球菌口服免疫鸡,降低空肠弯曲菌在鸡肠道中的定殖。【方法】利用PCR分别扩增空肠弯曲菌cfrA全基因及其N端片段,插入食品级表达载体pNZ8149多克隆位点并转化乳酸乳球菌NZ3900,通过Western blot鉴定重组菌株CfrA蛋白表达情况,同时通过筛选nisin浓度、温度、时间等诱导条件优化重组蛋白表达水平;进而将重组乳酸乳球菌经口服免疫SPF鸡,免疫后分别测定乳酸乳球菌自鸡体内的排出情况、以及诱导CfrA血清抗体和粘膜抗体水平,最后将空肠弯曲菌口服攻毒免疫后的鸡,通过测定鸡泄殖腔棉拭子中空肠弯曲菌的数目来判定口服免疫效果。【结果】Western blot检测显示CfrA全基因及其N端片段均可在重组乳酸乳球菌胞内可溶性表达,不分泌,筛选的最佳诱导表达条件为nisin浓度25 ng/mL、温度37°C、时间1 h。口服乳酸乳球菌10 d内自鸡体完全排空;鸡口服免疫后可产生CfrA蛋白特异性的血清IgG和肠粘膜sIgA抗体;重组乳酸乳球菌口服免疫后空肠弯曲菌在鸡体内的增殖速度显著低于对照组。【结论】成功构建了重组CfrA蛋白的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统;表达CfrA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫鸡对空肠弯曲菌在鸡肠道的定殖具有一定的抑制作用,为研制重组乳酸菌口服家禽免疫制剂防治空肠弯曲菌奠定了基础。

关键词：空肠弯曲菌肠菌素受体CfrA 乳酸乳球菌表达口服免疫

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犬细小病毒研究进展

动物医学进展 2019年第12期40卷 79-84页

作者：周宏专苏霞徐福洲杨兵北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是犬急性胃肠炎的主要致病因子之一,典型的临床症状包括呕吐、发热和腹泻,通常6周龄~6月龄的幼犬更易感染。20世纪70年代后期出现CPV-2后目前已在世界范围内流行。病原学研究显示CPV基因组替代率与RN... 详细信息

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是犬急性胃肠炎的主要致病因子之一,典型的临床症状包括呕吐、发热和腹泻,通常6周龄~6月龄的幼犬更易感染。20世纪70年代后期出现CPV-2后目前已在世界范围内流行。病原学研究显示CPV基因组替代率与RNA病毒相似,基因组中多个位点出现了新的变异,与病毒致病机制密切相关,引起了科研人员的广泛关注。在检测方面目前开展了多重聚合酶链反应(multiple PCR),聚合酶链式扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS-PCR),隔热式恒温PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR),高分辨率熔解曲线PCR(high-resolution melting PCR,PCR-HRM),横向流动试纸条技术(immunocapture-loop mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick,IC-LAMP-LFD),聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR),重组聚合酶扩增方法(recombinase polymerise amplification,RPA),Luminex液态悬浮芯片系统(Luminex xTAG)和免疫层析(immunochromatography,IC)等方法,在防控方面开展了核酸疫苗、重组亚单位苗、病毒样颗粒等新型疫苗以及治疗性药物研究。论文对CPV的流行病学、病原学、检测方法及防控措施等进行了综述。

关键词：犬细小病毒流行病学致病机理检测方法疫苗

用于检测仔猪致病菌的23S rRNA基因芯片的研制

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中国兽医科学 2010年第3期40卷 258-264页

作者：伍诚意曹峰子梁之昶章振华杨兵周宏专季海峰陈小玲北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京100097 江西生物科技职业学院江西南昌330200 河北农业大学动物科技学院河北保定071000 北京华大吉比爱生物技术有限公司北京101300 首都师范大学生命科学院北京100037

以副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、猪链球菌等12种仔猪致病菌为目标细菌,23SrRNA基因为靶基因,从GenBank中下载其23SrDNA全序列,在其变异区设计特异性探针,在保守区设计通用引物。通过序列... 详细信息

以副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、猪链球菌等12种仔猪致病菌为目标细菌,23SrRNA基因为靶基因,从GenBank中下载其23SrDNA全序列,在其变异区设计特异性探针,在保守区设计通用引物。通过序列分析、PCR靶标与探针杂交试验,建立了有13条寡核苷酸探针和2对通用引物的仔猪常见致病菌基因芯片检测方法。以参考菌株粗提基因组DNA的10倍系列稀释模板做PCR,扩增产物与探针杂交,检出芯片的灵敏度为100fg。对33个参考菌株用芯片检测,结果有1例不正确,只鉴定到属;在61个野外分离株中,55株的芯片检测结果与生化或测序结果一致,有6例不一致,符合率为90%。初步研究证明,该检测方法能快速、有效地鉴定多种仔猪常见致病菌,但要区分某些细菌的致病株与非致病株,还要检测毒力/毒素基因。

关键词：仔猪致病菌 23S rRNA基因芯片寡核苷酸探针