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DNA末端硫修饰依赖的体外大片段DNA连接法

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微生物学通报 2023年第3期50卷 1220-1230页

作者：胡媚月吴更上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200030

【背景】DNA组装技术是基因组合成中的一个关键技术。探索低成本、高效率的基因组合成技术一直是合成生物学的重要研究领域。在某些细菌如变铅青链霉菌中,DNA上有磷硫酰化修饰(简称硫修饰),而在另一些细菌如天蓝色链霉菌中存在一种含有... 详细信息

【背景】DNA组装技术是基因组合成中的一个关键技术。探索低成本、高效率的基因组合成技术一直是合成生物学的重要研究领域。在某些细菌如变铅青链霉菌中,DNA上有磷硫酰化修饰(简称硫修饰),而在另一些细菌如天蓝色链霉菌中存在一种含有硫修饰识别结构域(sulfur-binding domain,SBD)的识别蛋白,可以特异性识别DNA上的硫修饰,这启发了我们发展出一种新的DNA组装技术。【目的】探究在DNA末端硫修饰的连接中,T4 DNA连接酶与SBD相融合蛋白和单独的T4 DNA连接酶相比,是否有更高的连接效率。【方法】根据同源重组原理,设计硫修饰引物,扩增硫修饰的DNA片段。构建T4 DNA连接酶与SBD融合蛋白的3种表达载体T4-linker-SBD(Hga)、T4-linker-SBD(Spr)和T4-linker-SBD(Mmo),表达纯化以上3种融合蛋白。比较3组浓度梯度(2.4、0.24、0.024 mg/mL)T4 DNA连接酶与融合蛋白在2.5 kb和8.0 kb DNA片段连接上的差异。【结果】DNA末端硫修饰的2.5kb和8.0kb的两端片段均能扩增,而且3种融合蛋白均能表达。在两段2.5 kb片段的体外连接实验中,每组T4 DNA连接酶与融合蛋白均能连接成5 kb片段;然而在两段8.0 kb片段的体外连接实验中,相同连接时间和相同酶浓度下,仅融合蛋白T4-linker-SBD(Hga)能够将8.0 kb片段连接成16 kb的长片段。【结论】根据两组琼脂糖凝胶电泳的实验结果可知,在两段8.0 kb的DNA长片段连接实验中,T4-linker-SBD(Hga)融合蛋白具有更高的连接效率。本研究方法以较低的成本和比较高的效率为大片段DNA组装提供了一种新的方法和思路。

关键词：硫原子识别结构域 DNA连接组装 DNA硫修饰基因组合成

Amer1/WTX与APC相互作用的新结合位点鉴定

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中国生物化学与分子生物学报 2014年第4期30卷 383-389页

作者：肖亚飞吴更微生物代谢国家重点实验室上海交通大学生命科学技术学院上海200240

Amer1(APC membrane recruitment protein 1)又称为WTX(Wilms’tumor X),是首个发现位于X染色体上的抑癌基因.由于其定位的特殊性,Amer1近年来成为研究的热点之一.研究表明,Amer1作为骨架蛋白在细胞内与多种蛋白(APC,β-catenin,Axin等... 详细信息

Amer1(APC membrane recruitment protein 1)又称为WTX(Wilms’tumor X),是首个发现位于X染色体上的抑癌基因.由于其定位的特殊性,Amer1近年来成为研究的热点之一.研究表明,Amer1作为骨架蛋白在细胞内与多种蛋白(APC,β-catenin,Axin等)直接结合,在Wnt信号通路中发挥着重要功能.据报道Amer1/WTX含有3个肿瘤抑制蛋白质APC(adenomatous polyposis coli,APC)的结合位点,对于APC在细胞膜上的定位过程中发挥着重要的作用.但是,通过序列比对发现,Amer1可能存在第4个被忽略的APC的结合位点,定位于A1和A2之间.为了验证该片段能否与APC结合,分别构建了GST-Amer1(365-375)和His-APC(407-775)两种重组蛋白.通过GSTpull down,证明了这两个片段存在相互作用,并进一步通过ITC(isothermal titration calorimetry)实验测定了两者结合的亲和力.本研究结果不仅在体外证实了Amer1第4个APC结合位点的存在,也为APC和Amer1/WTX复合物的结构和功能的研究打下了良好的基础.

关键词： Amer1 WTX APC蛋白 ARM结构域 GST-pull down ITC

mTORC1通路中氨基酸信号转导相关机制研究进展

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中国细胞生物学学报 2012年第8期34卷 812-818页

作者：高源吴更微生物代谢国家重点实验室上海交通大学生命科学技术学院上海200240

雷帕霉素靶点蛋白(target of rapamycin,TOR)作为细胞内重要的生长和代谢调节中枢,主要通过形成两种复合物TORC1与TORC2发挥其功能。其中TORC1接收广泛的细胞内信号,如氨基酸水平、生长因子、能量以及缺氧状态等,通过调控蛋白质合成来... 详细信息

雷帕霉素靶点蛋白(target of rapamycin,TOR)作为细胞内重要的生长和代谢调节中枢,主要通过形成两种复合物TORC1与TORC2发挥其功能。其中TORC1接收广泛的细胞内信号,如氨基酸水平、生长因子、能量以及缺氧状态等,通过调控蛋白质合成来促进细胞的增殖与生长。在这些信号当中,氨基酸不仅能够激活TORC1通路,还同时作为其他信号激活TORC1的必需条件。目前,对于生长因子和能量水平激活TORC1过程的分子机制已有较深入的认识,而对于氨基酸信号如何转导至TORC1的分子机制直到近年来才有了新的突破。该文通过梳理已发表的哺乳动物细胞中氨基酸信号调控mTORC1分子机制的相关实验结论,对该领域的研究方向进行了总结和展望。

关键词： mTORC1 氨基酸信号转导 Rag GTPase Ragulator p62

SAP18和Sufu蛋白质复合物的表达纯化研究

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中国细胞生物学学报 2014年第2期36卷 205-210页

作者：安影吴更上海交通大学生命科学技术学院上海200240

通过分子克隆技术将Sufu和SAP18构建到原核载体,在原核表达系统进行外源表达,采用亲和层析和分子筛层析对Sufu和SAP18及其复合物进行纯化。同时利用非变性胶的方法进一步确定该蛋白之间的相互作用及结合比例。结果表明,原核表达系统中S... 详细信息

通过分子克隆技术将Sufu和SAP18构建到原核载体,在原核表达系统进行外源表达,采用亲和层析和分子筛层析对Sufu和SAP18及其复合物进行纯化。同时利用非变性胶的方法进一步确定该蛋白之间的相互作用及结合比例。结果表明,原核表达系统中Sufu和SAP18蛋白表达量高,可以纯化到高纯度的蛋白质。Sufu和SAP18结合的摩尔比为1:1,按摩尔比1:2混合、纯化可以得到高纯度、稳定的蛋白复合物,从而为进一步复合物的结构生物学研究奠定基础。

关键词： SAP18 Sufu 表达纯化相互作用

热牙胶垂直加压法行C形根管充填有效性及其对牙周指数水平、抗折能力影响

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临床军医杂志 2023年第10期51卷 1085-1087页

作者：杨雁吴更王亚琼连云港市第一人民医院口腔科江苏连云港222002

目的探讨热牙胶垂直加压法行C形根管充填的有效性及其对牙周指数水平和抗折能力的影响。方法选取自2021年2月至2022年2月连云港市第一人民医院收治的86例慢性牙髓炎、根尖周炎患者为研究对象。按随机数字表法将患者分为A组和B组,每组各4... 详细信息

目的探讨热牙胶垂直加压法行C形根管充填的有效性及其对牙周指数水平和抗折能力的影响。方法选取自2021年2月至2022年2月连云港市第一人民医院收治的86例慢性牙髓炎、根尖周炎患者为研究对象。按随机数字表法将患者分为A组和B组,每组各43例。A组给予冷侧方加压法治疗,B组给予热牙胶垂直加压法治疗。比较两组的临床疗效,根管充填质量,单根管充填所需时间,牙周指数水平,牙周疼痛程度,抗折能力。结果B组治疗总有效率为95.35%(41/43),高于A组的76.74%(33/43),差异有统计学意义(P<0.05)。B组恰填率高于A组,单根管充填所需时间短于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者牙龈指数、龈沟出血指数、牙周袋深度均较治疗前降低,且B组低于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。B组治疗后疼痛视觉模拟(VAS)评分、染料渗透长度均低于A组,抗压载荷高于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论热牙胶垂直加压法治疗慢性牙髓炎、根尖周炎临床疗效显著,能有效改善患者牙周指数水平,缓解疼痛,提高牙根抗折能力,还能减少操作时间,防止根尖微渗透。

关键词：热牙胶垂直加压法 C形根管充填有效性牙周指数抗折能力

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大蒜素对人牙周膜成纤维细胞的生物学作用

大蒜素对人牙周膜成纤维细胞的生物学作用

作者：吴更中南大学

学位级别：硕士

目的通过观察不同浓度大蒜素干预体外培养的人牙周膜成纤维细胞(又称人牙周韧带细胞,human periodontal ligament cells,HPDLCs),探讨在不同浓度大蒜素作用下,人牙周膜成纤维细胞增殖、总蛋白含量以及超微结构的变化。从细胞水平证明... 详细信息

目的通过观察不同浓度大蒜素干预体外培养的人牙周膜成纤维细胞(又称人牙周韧带细胞,human periodontal ligament cells,HPDLCs),探讨在不同浓度大蒜素作用下,人牙周膜成纤维细胞增殖、总蛋白含量以及超微结构的变化。从细胞水平证明大蒜素对HPDLCs的生物学作用,并初步探讨其可能的机制,为将其开发为一种根管内封药提供实验与理论根据。方法体外培养人牙周膜成纤维细胞,分别经0mg/l(对照组),10mg/l,10mg/l,1mg/1,10mg/l,10mg/l,10mg/l浓度的大蒜素作用后,采用MTT法、考马斯亮蓝染色法、透射电子显微镜技术,观察大蒜素对HPDLCs增殖、总蛋白含量、超微结构的影响。结果 (1)大蒜素浓度在10mg/l,10mg/l,1mg/l时对人牙周膜成纤维细胞增殖无明显影响,10mg/l,10mg/l,10mg/l时明显抑制人牙周膜成纤维细胞增殖,10mg/l效应最大。呈明显的剂量-依赖效应,其半数抑制率浓度约为22mg/l。 (2)大蒜素浓度为10mg/l,10mg/l,10mg/l时,均明显抑制HPDLCs的总蛋白含量,且大蒜素浓度为10mg/l时作用最大,单因素方差分析和S-N-K检验,有显著性差异(P＜0.05)。 (3)不同浓度大蒜素对人牙周膜成纤维细胞超微结构有不同程度的损伤,10 mg/l,10mg/l,10mg/l组的损伤作用明显。结论 (1)大蒜素对人牙周膜成纤维细胞的增殖和蛋白合成起抑制作用,呈剂量-效应依赖关系。在本实验条件下半数抑制率浓度为22mg/l。 (2)大蒜素对人牙周膜成纤维细胞的超微结构有不同程度的损伤。

关键词：大蒜素人牙周膜成纤维细胞细胞增殖总蛋白含量超微结构

稳定表达TSC1/TSC2蛋白质复合物的293T细胞系的建立

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中国细胞生物学学报 2012年第12期34卷 1215-1219页

作者：闫丽君吴更上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

我们使用Clonetech的同源重组酶连接人TSC1、TSC2全长蛋白编码cDNA ORF到pBudCE4.1真核细胞双元表达载体上,用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒pBudCE4.1/TSC2/TSC1导入293T细胞,用含125μg/mL Zeocin的培养基筛选稳定表达TSC1/TSC2蛋白的细胞株,并用Western blot方法鉴定稳转细胞株的稳定性。该实验成功建立了稳定表达TSC1/TSC2蛋白的293T细胞系,从而为今后研究TSC1/TSC2蛋白的结构与功能提供实验基础。

关键词： TSC1 TSC2 稳转细胞系真核细胞双元表达载体 Zeocin

抑制型Smad对TGF-β信号通路的负调控研究进展

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生物技术通报 2012年第5期28卷 31-37页

作者：高磊林葵吴更上海交通大学生命科学与技术学院、微生物代谢国家重点实验室上海200240

转化生长因子TGF-β超家族是一类在结构上相关的蛋白,目前发现在哺乳动物中有超过30多个细胞因子可能属于这一超家族。它们在各类细胞中广泛参与细胞生长、黏附、迁移、分化及凋亡等过程。其中抑制型Smad(I-Smads,包括Smad6和Smad7)是T... 详细信息

转化生长因子TGF-β超家族是一类在结构上相关的蛋白,目前发现在哺乳动物中有超过30多个细胞因子可能属于这一超家族。它们在各类细胞中广泛参与细胞生长、黏附、迁移、分化及凋亡等过程。其中抑制型Smad(I-Smads,包括Smad6和Smad7)是TGF-β/BMP信号通路里重要的抑制型蛋白,在多种细胞与组织的发育过程以及疾病的发生过程中扮演着重要的角色。对其研究已经过10多年,取得许多重大的进展,但也还有很多重要的问题还没有解决。着重介绍I-Smads对TGF-β信号通路的负调控研究进展。

关键词： TGF-β信号通路抑制型Smad Smad6 Smad7 负调控

人源γ-分泌酶的重要亚基nicastrin蛋白表达与纯化

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基因组学与应用生物学 2015年第5期34卷 909-916页

作者：齐佩瑾吴更微生物代谢国家重点实验室上海交通大学生命科学技术学院上海200240

γ-分泌酶是具有天冬氨酸内切酶活性跨膜蛋白复合物,与阿尔茨海默症的病理特征的β-淀粉样蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)生成有关。Nicastrin(NCT)是Ⅰ型单次跨膜糖蛋白,具有709个氨基酸。它是γ-分泌酶的重要组分,具有募集和结合γ-分... 详细信息

γ-分泌酶是具有天冬氨酸内切酶活性跨膜蛋白复合物,与阿尔茨海默症的病理特征的β-淀粉样蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)生成有关。Nicastrin(NCT)是Ⅰ型单次跨膜糖蛋白,具有709个氨基酸。它是γ-分泌酶的重要组分,具有募集和结合γ-分泌酶底物的功能,参与γ-分泌酶的组装过程。本研究中,利用昆虫杆状病毒表达系统表达人源NCT全长和胞外结构域,得到了纯度较好的蛋白,用于晶体初筛。由于nicastrin自身高度糖基化,使用Endo H和PNGase F去糖基化酶进行体外脱糖基作用,使得蛋白均一度提高,纯化到较稳定的胞外结构域蛋白,为下一步对人源nicastrin蛋白进行结构生物学研究奠定了基础。

关键词： γ-分泌酶 Nicastrin 蛋白表达纯化去糖基化