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非洲猪瘟病毒pH359L蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

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中国兽医学报 2022年第3期42卷 432-438页

作者：杨赛霞赵亚茹刘志杰杨吉飞张忠辉樊洁耿抒贤吕欣倩敬梦瑶殷宏牛庆丽国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)/中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为制备抗非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV) pH359L蛋白的多克隆抗体,本研究以GenBank登录的ASFV HLJ/18毒株基因序列设计H359L基因的特异性引物,扩增H359L基因并构建pET-28a-H359L原核表达质粒,将其转化至大肠杆菌BL21(D... 详细信息

为制备抗非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV) pH359L蛋白的多克隆抗体,本研究以GenBank登录的ASFV HLJ/18毒株基因序列设计H359L基因的特异性引物,扩增H359L基因并构建pET-28a-H359L原核表达质粒,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和镍柱亲和层析纯化蛋白后,免疫新西兰大白兔制备抗pH359L蛋白的多克隆抗体,通过Western blot和IFA试验对制备的抗体反应性进行测定。结果表明,构建的pET-28a-H359L重组质粒无点突变;重组蛋白pH359L在37℃以0.1 mmol/L的IPTG诱导表达量最高,其相对分子质量约为43.0 kDa,与预期大小一致;蛋白以包涵体形式表达;抗pH359L多克隆抗体效价达到1∶512 000;Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能够特异性识别ASFV感染猪肺泡巨噬细胞表达的天然pH359L蛋白。本研究为揭示ASFV pH359L蛋白的功能及ASFV相关的转录机制奠定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 pH359L 原核表达多克隆抗体

非洲猪瘟病毒pO174L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2022年第2期52卷 177-183页

作者：敬梦瑶牛庆丽杨吉飞吕欣倩樊洁赵亚茹杨赛霞张忠辉关贵全殷宏刘志杰中国农业科学院兰州兽医研究所国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为了解析非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pO174L蛋白的功能,根据ASFV HLJ/18毒株基因序列(GenBank登录号:MK333180)设计引物,扩增O174L基因并克隆至pET-28a(+)载体中,构建原核表达载体p ET-28a-O174L,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达后,通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定重组蛋白表达产物的抗原性,用重组蛋白免疫新西兰大白兔制备家兔抗pO174L蛋白的多克隆抗体;利用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价,并通过Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,用PCR扩增的O174L基因片段长564 bp,与预期相符;双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET-28a-O174L构建成功,在原核表达系统成功地表达并获得了可溶性蛋白pO174L,分子质量约为21.5 ku;用纯化的蛋白免疫动物后制备了多克隆抗体,抗体效价达到1∶512000;Western-blot和IFA结果显示制备的抗体能够特异性地识别ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞中表达的天然蛋白pO174L。本研究为深入解析pO174L蛋白的功能及其在ASFV感染和致病过程中的作用奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 pO174L蛋白原核表达多克隆抗体

非洲猪瘟病毒pNP419L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2021年第11期51卷 1392-1397页

作者：吕欣倩牛庆丽樊洁杨吉飞赵亚茹张忠辉杨赛霞敬梦瑶耿抒贤关贵全刘志杰殷宏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为了评估原核表达的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pNP419L蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值,将PCR扩增的NP419L基因片段插入载体pET-28a中,然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,以金属离子层析法纯化蛋白后... 详细信息

为了评估原核表达的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pNP419L蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值,将PCR扩增的NP419L基因片段插入载体pET-28a中,然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,以金属离子层析法纯化蛋白后,免疫新西兰大白兔制备家兔抗pNP419L多克隆抗体。结果显示,用PCR成功地扩增了NP419L基因序列,NP419L基因转入表达载体后被成功表达;纯化后的重组pNP419L蛋白的分子质量为42 ku;用间接ELISA检测家兔源多克隆抗体的效价达到1∶512000,IFA试验及Western-blot检测表明该多克隆抗体具有良好的反应性及特异性。本研究为pNP419L蛋白生物学功能的研究奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 NP419L基因原核表达多克隆抗体

基于非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的间接ELISA检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2021年第4期51卷 403-411页

作者：王兆贵赵亚茹杨吉飞牛庆丽刘银光敬梦瑶杨赛霞吕欣倩刘猛姚永海关贵全刘志杰殷宏国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)/中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046 白水江自然保护区管理局江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种危害性极强的病毒性疾病,该病的发生和流行对全球养猪业、猪肉食品供应及经济发展造成了巨大影响。ASFV基因组较大、编码蛋白众多,但目... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种危害性极强的病毒性疾病,该病的发生和流行对全球养猪业、猪肉食品供应及经济发展造成了巨大影响。ASFV基因组较大、编码蛋白众多,但目前很多病毒蛋白的功能尚不清楚。由于缺乏有效的治疗措施和安全的疫苗,所以ASF的防控及疫区的净化仍然面临巨大挑战,而早期、快速、可靠的实验室诊断仍然是该病防控的重要手段。本研究以ASFV基因Ⅱ型毒株的基因组为模板,扩增A104R、B602L、CP204L (P30)、B646L(P72)和K205R基因,并将其克隆至表达载体pET-30a,构建原核表达质粒,经IPTG诱导后表达5种病毒蛋白,其中p A104R、pK205R为可溶性表达,P30、P72、pB602L为包涵体表达。经Western-blot分析鉴定蛋白的抗原性,五种原核表达的蛋白都能够和ASF阳性血清发生特异性反应,通过比较,筛选出pA104R作为最佳诊断抗原,并初步建立了ASFV抗体检测间接ELISA方法。该方法能够敏感、特异的检测ASFV阳性血清,而与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清均无交叉反应。利用建立的间接ELISA方法与商品化间接ELISA抗体检测试剂盒平行检测田间样本,结果表明,本研究建立的方法与商品化试剂盒之间的符合率达到94.7%(142/150)。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法能够用于ASF血清抗体的检测。

关键词：非洲猪瘟非洲猪瘟病毒蛋白纯化间接ELISA