抗非洲猪瘟病毒pNP419L和pE296R蛋白抗体的制备及应用

作     者：吕欣倩 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：殷宏

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：ASFV NP419L E296R 多克隆抗体制备 生物信息学及功能分析 

摘      要：非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是一种急性传染病。ASFV碱基切除修复系统（Base Excision Repair system,BER）的重要组成部分,包括NP419L编码的DNA连接酶和E296R编码的AP核酸内切酶等。BER保证了ASFV基因组在靶细胞的高度氧化环境中保持了病毒基因组的完整性。本研究以pNP419L和pE296R蛋白为研究对象,探讨ASFV BER在ASFV感染过程中的表达特点和功能,具体内容如下:*** pNP419L和pE296R蛋白原核表达及其多克隆抗体制备首先根据ASFV NP419L和E296R基因序列信息,设计引物,获得NP419L和E296R目的基因片段,其中NP419L为1260 bp,E296R为891 bp,与预期结果一致。克隆构建相应的表达质粒p ET-28a-NP419L和p ET-28a-E296R,并将重组质粒转化至BL21感受态细胞中诱导表达。纯化的蛋白大小分别约为40 Ku和30 Ku,与理论值一致。将纯化的蛋白作为免疫原,皮下注射新西兰大白兔,3次免疫之后采集血清制备多克隆抗体。采用ELISA方法检测两种多抗的抗体效价,结果显示,制备的抗pNP419L兔源多克隆抗体与抗pE296R兔源多克隆抗体效价均达1:512000。将免疫后采集的血清与病毒混合孵育后感染PAM细胞,利用HAD检测抗体中和能力,结果显示,抗pNP419L家兔抗血清中和效价为6.31,抗pE296R蛋白抗血清中和效价为16,均具有一定程度中和病毒的能力。*** NP419L和E296R生物信息学与功能分析通过对两种蛋白的生物信息学分析可知,ASFV的pNP419L、pE296R蛋白等电点分别为9.35、8.59,均属于碱性蛋白质。蛋白的不稳定系数分析结果表明,pNP419L和pE296R蛋白为稳定蛋白。用q PCR检测ASFV感染过程中NP419L和E296R基因的转录时序及其在感染ASFV的家猪的心、肝、脾、肺和肾中的基因转录水平。结果显示,两种蛋白属于感染早期开始表达的蛋白。感染脏器中表达水平较高的是肺脏,推测在ASFV感染过程中,肺脏中存在大量氧自由基（ROS）,会引起ASFV基因组DNA损伤,因此,碱基切除修复系统成员pNP419L和pE296R表达量较高。阿糖胞苷（Arac）抑制晚期蛋白的合成,检测其对pNP419L和pE296R蛋白表达影响,结果进一步表明两种蛋白均为早期表达蛋白。将制备成功的抗pNP419L和抗pE296R的血清作为一抗,通过间接免疫荧光试验（IFA）对pNP419L和pE296R蛋白在ASFV感染靶细胞后的亚细胞定位进行分析。同时将真核质粒pc DNA3.1-pNP419L和pc DNA3.1-pE296R转染到猪肾细胞（PK-15）,罗猴胎肾细胞（MA104R）和人肾上皮细胞（HEK293T）中,通过IFA检测亚细胞定位。结果表明,两种蛋白均位于细胞质中。将质粒pc DNA3.1-pNP419L和pc DNA3.1-pE296R转染入MA104R细胞中,再进行ASFV感染,检测两种蛋白对ASFV复制能力的影响,发现过表达两种蛋白均促进病毒复制。设计NP419L和E296R相应的si RNA敲低两种基因的表达后,发现干扰这两个基因的表达抑制了病毒的复制。综上所述,本研究发现ASFV的BER成员pNP419L和pE296R在ASFV复制过程中起着重要的作用,为早期开始表达的蛋白,研究结果为ASFV致病机制的研究奠定了基础