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作者：卢争辉湖北大学

学位级别：硕士

淀粉酶是最早实现工业应用并且是迄今为止用量最大的商品化酶制剂,约占全球酶制剂市场份额的30%。碱性α-淀粉酶是一类在碱性条件下具有最高催化活力和稳定性的淀粉酶,被广泛应用于纺织退浆和洗涤添加剂等工业领域中。然而目前商品化应... 详细信息

淀粉酶是最早实现工业应用并且是迄今为止用量最大的商品化酶制剂,约占全球酶制剂市场份额的30%。碱性α-淀粉酶是一类在碱性条件下具有最高催化活力和稳定性的淀粉酶,被广泛应用于纺织退浆和洗涤添加剂等工业领域中。然而目前商品化应用的碱性α-淀粉酶在工业生产环境中普遍存在酶活低、热稳定性差和碱不稳定等不足,极大地限制了它们的应用范围,亟需研究者从自然界中挖掘新的碱性α-淀粉酶基因扩充基因资源数据库,并通过各种分子改造策略对野生型淀粉酶进行改造,使其满足工业生产应用的要求。本研究从新酶基因的挖掘出发,克隆得到一种新的碱性α-淀粉酶,并对其进行酶学性质分析。通过同源建模得到该α-淀粉酶的三维空间结构,在此基础上,对其进行结构域改造,使该酶的热稳定性、催化效率及表达量等大幅提高。具体研究内容及实验结果如下:1.新酶基因的挖掘:通过Horikoshi培养基从土壤样品中筛选到一株高产碱性α-淀粉酶的菌株,通过16S rDNA序列同源性比对,发现该菌与兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmusOF4 的 16S rDNA 序列一致性为 100%,将该菌命名为Bacilluspseudofirmus 703。通过PCR克隆得到碱性Α-淀粉酶基因Amy703,通过氨基酸序列分析表明该酶具有Α-淀粉酶的7个保守区域,对其进行聚类分析发现该Α-淀粉酶属于糖苷水解酶13家族(GH13)中的新亚类,属于一个新的α-淀粉酶。2.酶学性质分析:将Amy703在大肠杆菌中异源表达,纯化后,对其进行酶学性质分析。结果显示Amy703的最适反应条件为40℃和pH 9.0,其在40 ℃以下的稳定性较好,在35℃处理20min后,残余酶活在95%以上,同时,该酶具有很好的碱稳定性,在4℃下于pH 8.0-10.5范围内处理12 h后残余酶活高于80%。Ca2+和Mg2+能极大促进该酶的酶活,当反应体系中含有10 mM Ca2+和Mg2+时,相对酶活分别提高了 2倍和2.48倍,EDTA几乎使该酶完全失活,说明该酶为金属酶。该酶的最适反应底物为可溶性淀粉,Km值为3.92mg/ml,Vmax为17.664 nmol/min/mg,该酶对支链淀粉也具有较大的水解活性,并能水解直链淀粉和糖原。此外,通过定点突变技术验证了该酶的催化三联体结构。3.结构模拟和分子改造。基于合成酶学中的活性部位与蛋白质骨架原理,只要维持活性部位的构象,蛋白质的骨架部分可以增、减和替换。由于目前存在的大部分蛋白质均属于模块化蛋白质,即蛋白质结构由二个或二个以上具有相对独立的结构域和执行特定功能的结构域构成,我们推测通过结构域的改造,包括删除、融合和替换,使蛋白质的整体骨架发生变化,从而可能获得催化效率、稳定性等多种酶学性质改变的突变体酶。利用MOE软件对Amy703进行结构模拟分析,结果显示该酶由四个结构域组成,N端结构域在已酶学性质表征的淀粉酶中均不存在,是Amy703特有的结构域。作为上述推测的验证,我们分别及组合缺失了 Amy703的N端和C端结构域(DomainC),得到3个Amy703突变体,即N端结构域缺失的N-Amy703、C端结构域缺失的C-Amy703和两端结构域缺失的(N+C)-Amy703。由于已有研究证实第二个结构域(DomainB)与TIM barrel之间的相互作用在维持Α-淀粉酶的结构稳定性与催化活性方面具有重要作用,因此本研究没有对其进行缺失突变分析。4.突变体的酶学性质分析。将上述三个突变体分别在大肠杆菌中诱导、纯化后,测定突变体的比酶活,发现N端结构域缺失突变体N-Amy703的比酶活(U/mg)为170.2,是Amy703的40倍,而C-Amy703与(N+C)-Amy703的比酶活均比Amy703低,因此选择N-Amy703做进一步酶学性质分析。结果表明N-Amy703的最适反应温度为50 ℃,比 Amy703 提高了 10℃,最适 pH 从 Amy703 的 pH 9.0 提高到 pH 9.5。N-Amy703 的热稳定性也有较大改善,在50℃的半衰期是Amy703的3-4倍。N-Amy703对可溶性淀粉的为 11.88 mg/ml,最大反应速率Vm 为 659.2 μmol/min/mg,Kcat 为 50182 min-1,Kcat/Km 为 4224.1 L/(g·min)。而 Amy703 的 Vmax 为 17.7nmol/min/mg,Kcat 为 1943 min-1,Kcat/Km为495.7L/(g·min)。由此可知,N-Amy703的催化常数(Kcat)是野生型酶Amy703的25.8倍,N-Amy703的催化效率(Kcat/Km)是Amy703的8.52倍。N端结构域氨基酸序列比对发现N端结构域含有一个保守的蛋白结构域家族Eet,这个家族的部分成员最近被确定为CBM 48(Carbohydrate Binding Mo

关键词：碱性淀粉酶酶学性质分析结构模拟 N端缺失

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优化酵母浸粉组分提高大肠杆菌BL21 (DE3) 的发酵性能

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食品与发酵工业 2023年

作者：杨坤鹏李世宇杨移志伍业旭覃先武卢争辉安琪酵母股份有限公司湖北大学生物催化与酶工程国家重点实验室

酵母浸粉常被用作微生物培养的氮、维生素和矿物质的来源，是微生物生长与发酵性能的关键影响因素。本研究分析了氨基酸富集型、核苷酸富集型、维生素富集型、微量元素富集型等不同类型酵母浸粉产品对大肠杆菌BL21 (DE3)生长与报告基因... 详细信息

酵母浸粉常被用作微生物培养的氮、维生素和矿物质的来源，是微生物生长与发酵性能的关键影响因素。本研究分析了氨基酸富集型、核苷酸富集型、维生素富集型、微量元素富集型等不同类型酵母浸粉产品对大肠杆菌BL21 (DE3)生长与报告基因绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达的影响，结果表明富含RNA和海藻糖的酵母浸粉对重组大肠杆菌BL21 (DE3)-pET28a-gfp细胞生长和GFP表达的综合效果最好。为了进一步优化酵母浸粉组分提高重组大肠杆菌的发酵性能，在富含RNA和海藻糖的酵母浸粉中分别添加氨基酸类、维生素类和糖类成分，发现外源添加维生素E、维生素B6、甲硫氨酸、核黄素、谷氨酸、色氨酸、山梨醇、异亮氨酸等对重组大肠杆菌GFP表达具有促进作用，谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸等能提高重组大肠杆菌生物量。对维生素E、谷氨酸、核黄素、维生素C、甲硫氨酸五种添加物进行五因素中心组合设计试验，分别使细胞生长与GFP表达水平提高27%和24%。该研究的结果有助于研制能提高微生物发酵性能的新型酵母浸粉。

关键词：酵母浸粉培养基优化细胞生长蛋白表达

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枯草芽孢杆菌SCK6超级感受态的制备和转化条件优化

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生物工程学报 2017年第4期33卷 692-698页

作者：李信志卢争辉周玉玲李世宇张桂敏湖北大学生命科学学院生物资源绿色转化湖北省协同创新中心湖北武汉430062

枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性好氧细菌,因其安全性和高分泌特性,已被广泛用作异源蛋白的表达宿主。然而,相比大肠杆菌,枯草芽孢杆菌的转化效率低,限制了其作为宿主的异源蛋白的定向进化。本文通过改变培养基、诱导剂浓度、质粒类型等... 详细信息

枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性好氧细菌,因其安全性和高分泌特性,已被广泛用作异源蛋白的表达宿主。然而,相比大肠杆菌,枯草芽孢杆菌的转化效率低,限制了其作为宿主的异源蛋白的定向进化。本文通过改变培养基、诱导剂浓度、质粒类型等参数优化感受态制备的条件,利用常规质粒进行转化,结果表明,用营养丰富的YN培养基替代常规LB培养基制备感受态,可以使转化效率提高4倍左右;加入1.5%的木糖诱导2 h,感受态的转化效率又提高2倍左右;用大肠杆菌Escherichia coli GM272来源的质粒又可进一步提高转化效率3倍左右。综合最优条件制备SCK6的感受态,转化整合型质粒pDG1730,效率可以达到10~6 CFU/μg,相对未优化的条件提高了2个数量级,为基于枯草芽孢杆菌的酶的定向进化和代谢工程奠定了基础。

关键词：枯草芽孢杆菌 ComK基因木糖感受态 pDG1730

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碱性果胶酶高产菌株的构建和高密度发酵

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生物工程学报 2017年第12期33卷 2017-2027页

作者：望潇文向腊徐婷卢争辉张桂敏湖北大学生命科学学院生物资源绿色转化湖北省协同创新中心湖北武汉430062

碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮相比,具有保护纤维、降低能耗和化学污染的优势,因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌,低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义。前期研究工作已... 详细信息

碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮相比,具有保护纤维、降低能耗和化学污染的优势,因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌,低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义。前期研究工作已经将来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的碱性果胶酶基因pel经过密码子优化后在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中成功表达。本研究为了提高其表达量,首先利用启动子和信号肽都优化的载体pHBM905BDM进行表达,摇瓶酶活从68 U/mL增加到100 U/mL,qPCR检测转录水平提高了27%。再利用果胶底物平板筛选水解圈大的转化子进行摇瓶发酵获得菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,摇瓶酶活为536 U/mL。随后构建重组质粒pPIC9K-pels,电转化菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,利用抗生素G418平板进行筛选,在含4 mg/mL的G418抗性平板上得到菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1,摇瓶酶活为770 U/mL,qPCR测定含7个拷贝目的基因。最后将该菌株在5 L的发酵罐中进行高密度发酵,果胶酶酶活提高至2 271 U/mL。该碱性果胶酶酶活已达到目前酵母表达的最高水平,说明其具有很好的应用于纺织工业的潜力。

关键词：碱性果胶酶毕赤酵母 G418抗性标记组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记高密度发酵

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启动子工程和CRISPRa系统提高外源蛋白在枯草杆菌中的表达

启动子工程和CRISPRa系统提高外源蛋白在枯草杆菌中的表达

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第十一届中国酶工程学术研讨会

作者：卢争辉袁芯沈盼盼张桂敏湖北大学

枯草芽孢杆菌具有遗传背景清楚、分泌能力强、无致病性、无明显的密码子偏好性及发酵技术成熟等优点,是重要的工业酶蛋白表达系统之一。在原核生物中,使用强启动子元件提高目的基因转录水平是实现外源蛋白高效表达的重要方式。为了在枯... 详细信息

枯草芽孢杆菌具有遗传背景清楚、分泌能力强、无致病性、无明显的密码子偏好性及发酵技术成熟等优点,是重要的工业酶蛋白表达系统之一。在原核生物中,使用强启动子元件提高目的基因转录水平是实现外源蛋白高效表达的重要方式。为了在枯草杆菌中直接构建启动子文库筛选高效启动子,我们首先建立了枯草杆菌超级感受态的制备方法,质粒感受态效率达到1×10cfu/μg。在此基础上,以GFP为报告基因构建了启动子文库,然而,将筛选到的强启动子用于表达淀粉酶BLA时,发现BLA的表达量不高,且与启动子的强弱不成正比,暗示启动子具有一定的基因特异性。针对上述现象,我们建立了一种简便的启动子组合文库构建方法,使用寡核苷酸退火和金门克隆方法,实现启动子片段的随机组合,转化后即可得到启动子组合文库。同时,我们利用CRISPR/cas9系统在整合位点处引入DNA双链断裂,从而提高文库片段的整合效率,及减少探针载体自连的背景。通过上述方法对淀粉酶BLA构建启动子文库,筛选得到30多个强度远高于P43的启动子序列。该方法也可同时针对不同的基因构建启动子组合文库,通过对代谢途径中不同关键酶的表达进行组合调控,实现代谢流的平衡。为了进一步提高目的基因的表达量,我们在枯草杆菌中构建了CRISPRa系统,以GFP和BLA为报告基因,分别设计靶向启动子上游不同位点的sgRNA,证明该系统能够特异性、可调控地提高靶向基因的表达量。

关键词：枯草芽孢杆菌外源蛋白蛋白表达启动子工程 CRISPRa系统

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感受态还是芽胞?细胞命运决定的遗传调控网络

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生物工程学报 2015年第11期31卷 1543-1552页

作者：卢争辉周玉玲张晓舟张桂敏生物资源绿色转化湖北省协同创新中心湖北大学生命科学学院湖北武汉430062 青岛蔚蓝生物集团有限公司山东青岛266001

枯草芽胞杆菌作为一般认为安全(GRAS,Generally recognized as safe)菌株,被广泛应用于饲料、食品、生物防治等领域,同时,枯草芽胞杆菌作为表达宿主在工业酶的应用中扮演重要角色。然而,低效的芽胞形成率与感受态效率极大限制了枯草芽... 详细信息

枯草芽胞杆菌作为一般认为安全(GRAS,Generally recognized as safe)菌株,被广泛应用于饲料、食品、生物防治等领域,同时,枯草芽胞杆菌作为表达宿主在工业酶的应用中扮演重要角色。然而,低效的芽胞形成率与感受态效率极大限制了枯草芽胞杆菌的应用潜力。尽管已有大量关于芽胞形成与感受态形成的分子遗传机制的研究报道,但是通过遗传改造提高枯草芽胞杆菌芽胞形成率与感受态效率的研究报道并不多。可能的原因是芽胞形成与感受态形成作为枯草芽胞杆菌生长后期两个主要的发育事件,受胞内复杂的遗传调控机制操纵,且两个遗传通路之间存在相互调控关系,对遗传改造工作形成挑战。随着基因工程与代谢工程研究的不断发展,积累了大量关于细胞生长、代谢与发育等方面的遗传信息,通过综合这些遗传信息构建细胞遗传调控网络,用于指导生产实践,已经成为当前研究的热点之一。基于此,本文简要概述了枯草芽胞杆菌芽胞形成和感受态形成的遗传通路,初步探讨了芽胞形成与感受态形成之间的遗传调控网络,及细胞在生长后期的遗传决定机制,并讨论了该遗传调控网络对枯草芽孢杆菌及其近缘种应用研究的指导作用。

关键词：芽胞形成感受态发育遗传调控网络

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一个新的嗜盐淀粉酶HaAmy和其末端结构域对性质的影响

一个新的嗜盐淀粉酶HaAmy和其末端结构域对性质的影响

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第十二届中国酶工程学术研讨会

作者：胡鑫霖毛良伟向腊卢争辉张桂敏省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北大学

＜正＞随着绿色工业的蓬勃发展,适合工业应用的耐高温、耐酸或碱、耐高盐的酶制剂正在被快速的开发和应用。嗜盐淀粉酶在高盐浓度下能保持良好的酶活和稳定性,所以在造纸、医药、污水处理等方向更具应用潜力。本研究合成了来源于嗜盐杆...

＜正＞随着绿色工业的蓬勃发展,适合工业应用的耐高温、耐酸或碱、耐高盐的酶制剂正在被快速的开发和应用。嗜盐淀粉酶在高盐浓度下能保持良好的酶活和稳定性,所以在造纸、医药、污水处理等方向更具应用潜力。本研究合成了来源于嗜盐杆菌（Halobacillus halophilus DSM 2266）的α-淀粉酶基因haamy并在大肠

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一株碱性淀粉酶产生菌的分离及酶学特性分析

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安徽农业科学 2013年第7期41卷 2857-2859页

作者：卢争辉何家亨张桂敏湖北大学生命科学学院湖北武汉430062

[目的]筛选出能用于生物印染的碱性淀粉酶产生菌。[方法]利用Horikoshi培养基从农田土壤中分离碱性淀粉酶产生菌,并采用DNS法和碘量法测定粗酶液中淀粉酶的酶学性质。[结果]共分离到9株碱性淀粉酶产生菌,对其中水解圈最大的菌株703进行1... 详细信息

[目的]筛选出能用于生物印染的碱性淀粉酶产生菌。[方法]利用Horikoshi培养基从农田土壤中分离碱性淀粉酶产生菌,并采用DNS法和碘量法测定粗酶液中淀粉酶的酶学性质。[结果]共分离到9株碱性淀粉酶产生菌,对其中水解圈最大的菌株703进行16S rDNA序列同源性比对,结果显示其与嗜碱性芽孢杆菌Bacillus pseudofirmus OF4的16S rDNA序列一致性达100%。对该菌发酵粗酶的酶学性质研究表明该碱性淀粉酶的最适温度为50℃,最适pH为9.5,50℃下处理30 min后酶活残存74.7%。[结论]该研究筛选出了能用于生物印染的碱性淀粉酶产生菌,所产淀粉酶热稳定性较好,且具有强的碱耐受性,表明该酶具有应用于生物印染的潜在利用价值。

关键词：碱性淀粉酶 16S rDNA序列 Bacillus pseudofirmus 酶学性质

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一种高活性的低温碱性普鲁兰酶

一种高活性的低温碱性普鲁兰酶

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第十一届中国酶工程学术研讨会

作者：胡鑫霖卢争辉沈盼盼周玉玲张桂敏生物催化技术湖北省工程实验室湖北大学

普鲁兰酶是在普鲁兰糖和淀粉中水解α-1,6-糖苷键的脱支酶。目前淀粉工业中使用的α-淀粉酶,淀粉葡萄糖苷酶水解支链淀粉的效率不高,在糖化反应中添加的普鲁兰酶一般来源于嗜热菌,催化反应温度高于60℃。目前冷淀粉水解日益受到重视,因... 详细信息

普鲁兰酶是在普鲁兰糖和淀粉中水解α-1,6-糖苷键的脱支酶。目前淀粉工业中使用的α-淀粉酶,淀粉葡萄糖苷酶水解支链淀粉的效率不高,在糖化反应中添加的普鲁兰酶一般来源于嗜热菌,催化反应温度高于60℃。目前冷淀粉水解日益受到重视,因此开发具有高催化效率的冷适应普鲁兰酶具有重要意义。本研究从中温碱性芽孢杆菌中克隆到一个新的普鲁兰酶基因,其编码蛋白Pul703和已经报道的普鲁兰酶具有60%的氨基酸一致性。异源表达纯化蛋白进行表征分析发现Pul703最适作用温度为45℃,在25-35℃的温度下孵育360分钟后残余活性超过85%,具有良好的低温稳定性。底物特异性分析确认该酶为Ⅰ型普鲁兰酶,对普鲁兰糖的比酶活为270 U/mg,水解效率高于所有报道的I型普鲁兰酶。Pul703酶最适作用pH为7.0-8.0,在5.5-9.5的宽pH范围内具有高活性和稳定性,孵育12小时后均有80%以上的残余活性。Pul703酶具有较强EDTA和表面活性剂耐受性,在10 mM EDTA,10%Triton-X100和Tween20存在下,相对活性分别为100%,99%和114.8%。在1%和10%的尿素存在下,其活性分别提高4倍和1.3倍。总之,Pul703的这种低温特性、宽泛的pH作用范围和耐受性,耐螯合剂,耐表面活性剂和变性剂的综合特性,使其在低温淀粉水解工业上具有应用的潜力。

关键词：低温碱性普鲁兰酶异源表达蛋白纯化底物特异性

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“侦协办”运行需要厘清的几对关系

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检察风云 2023年第21期 54-55页

作者：张争辉孙娟卢怡璇上海市嘉定区人民检察院第一检察部上海市嘉定区人民检察院

如何确保侦查监督与协作配合办公室规范化、实质化、长效化运行,有几对关系需要进一步厘清。2021年10月31日,最高人民检察院、公安部联合制定下发了《关于健全完善侦查监督与协作配合机制的意见》(以下简称《意见》),旨在推动提升公安... 详细信息

如何确保侦查监督与协作配合办公室规范化、实质化、长效化运行,有几对关系需要进一步厘清。2021年10月31日,最高人民检察院、公安部联合制定下发了《关于健全完善侦查监督与协作配合机制的意见》(以下简称《意见》),旨在推动提升公安执法和检察监督规范化水平,确保依法履行刑事诉讼职能,实现惩罚犯罪与保障人权并重的目标,努力让人民群众在每一个司法案件中都能感受到公平正义。

关键词：侦查监督检察监督司法案件公安执法实质化长效化惩罚犯罪《意见》

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