启动子工程和CRISPRa系统提高外源蛋白在枯草杆菌中的表达
作者单位：湖北大学
会议名称：《第十一届中国酶工程学术研讨会》
会议日期：2017年
学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学]
关 键 词：枯草芽孢杆菌 外源蛋白 蛋白表达 启动子工程 CRISPRa系统
摘 要：枯草芽孢杆菌具有遗传背景清楚、分泌能力强、无致病性、无明显的密码子偏好性及发酵技术成熟等优点,是重要的工业酶蛋白表达系统之一。在原核生物中,使用强启动子元件提高目的基因转录水平是实现外源蛋白高效表达的重要方式。为了在枯草杆菌中直接构建启动子文库筛选高效启动子,我们首先建立了枯草杆菌超级感受态的制备方法,质粒感受态效率达到1×10cfu/μg。在此基础上,以GFP为报告基因构建了启动子文库,然而,将筛选到的强启动子用于表达淀粉酶BLA时,发现BLA的表达量不高,且与启动子的强弱不成正比,暗示启动子具有一定的基因特异性。针对上述现象,我们建立了一种简便的启动子组合文库构建方法,使用寡核苷酸退火和金门克隆方法,实现启动子片段的随机组合,转化后即可得到启动子组合文库。同时,我们利用CRISPR/cas9系统在整合位点处引入DNA双链断裂,从而提高文库片段的整合效率,及减少探针载体自连的背景。通过上述方法对淀粉酶BLA构建启动子文库,筛选得到30多个强度远高于P43的启动子序列。该方法也可同时针对不同的基因构建启动子组合文库,通过对代谢途径中不同关键酶的表达进行组合调控,实现代谢流的平衡。为了进一步提高目的基因的表达量,我们在枯草杆菌中构建了CRISPRa系统,以GFP和BLA为报告基因,分别设计靶向启动子上游不同位点的sgRNA,证明该系统能够特异性、可调控地提高靶向基因的表达量。