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皱纹盘鲍脏器糖蛋白分离纯化及其免疫活性的研究

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皱纹盘鲍脏器糖蛋白分离纯化及其免疫活性的研究

作者：包郁明中国海洋大学

学位级别：硕士

皱纹盘鲍隶属于软体动物门、腹足纲，是我国主要的养殖鲍鱼品种。近年来，随着杂交育种和北鲍南养技术的突破，皱纹盘鲍产量大增，但在皱纹盘鲍深加工过程中，占其软组织重量300%的脏器经常被废弃，造成了资源浪费和环境污染。已有研究... 详细信息

皱纹盘鲍隶属于软体动物门、腹足纲，是我国主要的养殖鲍鱼品种。近年来，随着杂交育种和北鲍南养技术的突破，皱纹盘鲍产量大增，但在皱纹盘鲍深加工过程中，占其软组织重量300%的脏器经常被废弃，造成了资源浪费和环境污染。已有研究发现皱纹盘鲍性腺多糖具有增强机体免疫、抑制肿瘤生长、抗氧化等功能;皱纹盘鲍性腺甾醇类物质也具有显著的免疫调节功能和抗疲劳功效。但皱纹盘鲍脏器糖蛋白方面的系统研究鲜有涉及。因此，本文以皱纹盘鲍脏器为研究对象，对其中的糖蛋白进行系统的分离纯化研究，并考察其在免疫调节活性方面的功能，旨在为皱纹盘鲍脏器综合加工利用提供基础理论依据。本文主要获得以下研究结果： 1.皱纹盘鲍脏器营养成分分析表明：皱纹盘鲍脏器水分、蛋白及粗脂含量较高，分别为湿重的74.6%、13.6%、5.1%，而总糖含量较低，为湿重的0.6%。 2.皱纹盘鲍脏器糖蛋白提取工艺的研究表明：在浸提液浓度0.2mol/L，料液比1:9，超声处理时间为40min，超声波功率为300W的条件下，目标糖蛋白得率为69.7mg/g。 3.皱纹盘鲍脏器糖蛋白分级纯化的研究表明，皱纹盘鲍脏器糖蛋白提取液经硫酸铵沉淀，DEAE-Cellulous52柱层析、Sephadex G-100柱层析、SephacrylS-300HR柱层析后，经SDS-PAGE电泳鉴定得到分子量为73.7KDa的组成均一的糖蛋白AGP-Ⅲ，AGP-Ⅲ含有总糖12.4%，总蛋白76.6%。 4.皱纹盘鲍脏器糖蛋白AGP-Ⅲ的初步分析表明，AGP-Ⅲ的单糖组成主要有岩藻糖、半乳糖、氨基葡萄、甘露糖、氨基半乳糖、木糖、葡萄糖和鼠李糖。AGP-Ⅲ含有17氨基酸，其中以缬氨酸含量最高，其次为谷氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸。红外光谱表明AGP-Ⅲ中存在糖和蛋白复合物的特征吸收峰和β折叠结构、糖苷键类型为吡喃型。β-消去反应前后紫外扫描图谱的变化表明AGP-Ⅲ有O-糖肽键的存在。 5.皱纹盘鲍脏器糖蛋白对小鼠免疫调节作用的实验，通过连续皮下注射氢化可的松建立小鼠免疫机能低下模型，以不同剂量的皱纹盘鲍脏器糖蛋白灌胃模型小鼠，探讨了皱纹盘鲍脏器糖蛋白对小鼠免疫机能的调节作用。结果表明，皱纹盘鲍脏器糖蛋白在一定程度上能提高免疫底下小鼠的脾指数，但不能逆转氢化可的松引起的免疫器官萎缩;皱纹盘鲍脏器糖蛋白能显著提高免疫低下小鼠的细胞免疫和非特异性免疫功能，尤其是中、高剂量组的作用效果显著。 ***-Ⅲ在一定浓度范围内对流感神经氨酸酶活性有一定抑制作用。

关键词：皱纹盘鲍脏器糖蛋白分离纯化免疫活性

鲍鱼脏器糖蛋白超声辅助提取工艺及分离纯化的研究

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食品与发酵工业 2011年第9期37卷 11-15页

作者：包郁明陶宇侯虎赵雪李八方中国海洋大学食品与工程学院

以冻藏鲍鱼脏器为试验原料,分析了鲍鱼脏器的基本成分组成,研究了鲍鱼脏器糖蛋白的分离纯化及纯化物基本组成。通过单因素试验、正交试验确定了最适提取条件为:5%NaCl溶液、料液质量比1∶9、超声功率为300 W、超声处理时间为40 min,在... 详细信息

以冻藏鲍鱼脏器为试验原料,分析了鲍鱼脏器的基本成分组成,研究了鲍鱼脏器糖蛋白的分离纯化及纯化物基本组成。通过单因素试验、正交试验确定了最适提取条件为:5%NaCl溶液、料液质量比1∶9、超声功率为300 W、超声处理时间为40 min,在此条件下,糖蛋白提取率为69.7 mg/g(干重),比传统方法提高了28.5%。糖蛋白粗品经硫酸铵沉淀,DEAE-Cellulous 52柱层析,SephacrylS-300 HR柱层析后,经SDS-PAGE电泳鉴定得到分子质量为73.7 ku的组成均一的糖蛋白AGP-Ⅱ,AGP-Ⅱ含有总糖12.4%,总蛋白76.6%。

关键词：鲍鱼脏器糖蛋白超声提取分级层析纯化

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棉籽抗菌活性肽的分离纯化及鉴定

食品科学 2017年第11期38卷 122-127页

作者：韩晓燕包郁明辛凤姣黄颖 Christophe BLECKER 戴小枫中国农业科学院农产品加工研究所农业部农产品加工重点实验室北京100193 列日大学食品学院比利时列日999013

通过体外模拟消化系统对棉籽分离蛋白(cottonseed protein isolate,CPI)进行酶解,得到具有抗菌活性的酶解产物,并采用超滤(ultrafiltration,UF)、阴离子交换色谱(anion exchange chromatography,AEC)、半制备高效液相色谱(semi-preparation high performance liquid chromatography,semi-P-HPLC)分离技术对棉籽抗菌活性肽进行分离纯化,用电喷雾串联质谱(electrospray ionization-tandem mass spectrometry,ESI-MS/MS)鉴定棉籽抗菌肽的氨基酸序列。在抗菌活性肽分离纯化过程中,用UF对具有抗菌活性的CPI酶解产物进行分离,得到3个组分U-Ⅰ~U-Ⅲ。抗菌活性检测表明U-Ⅲ的抗菌能力最强;用AEC分离U-Ⅲ得到3个组分QF-Ⅰ~QF-Ⅲ,其中QF-Ⅱ抗菌能力最强;进一步采用semi-P-HPLC分离QF-Ⅱ得到4个组分PF-Ⅰ~PF-Ⅳ,其中PF-Ⅲ的抗菌能力最强,经HPLC检测为单一峰,ESI-MS/MS检测分析得到该肽的氨基酸序列为ISGLIYEETR(Ile-Ser-Gly-Leu-Ile-Tyr-Glu-Glu-Thr-Arg)。

关键词：棉籽分离蛋白酶解产物抗菌活性肽分离纯化氨基酸序列

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鳕鱼皮胶原蛋白肽的抗酒精性胃溃疡作用

中国海洋药物 2012年第5期31卷 17-22页

作者：王志聪孙京沙倪鑫侯虎包郁明李八方中国海洋大学山东青岛266003

目的探究鳕鱼皮胶原蛋白及其酶解梯级多肽的抗酒精性胃溃疡作用。方法从鳕鱼皮中提取胶原蛋白并酶解成不同分子量段的胶原肽,采用酒精诱导大鼠急性胃溃疡模型,试验组灌胃给予不同剂量的胶原肽,检测胃溃疡指数、胃溃疡抑制率并对胃溃疡... 详细信息

目的探究鳕鱼皮胶原蛋白及其酶解梯级多肽的抗酒精性胃溃疡作用。方法从鳕鱼皮中提取胶原蛋白并酶解成不同分子量段的胶原肽,采用酒精诱导大鼠急性胃溃疡模型,试验组灌胃给予不同剂量的胶原肽,检测胃溃疡指数、胃溃疡抑制率并对胃溃疡病灶部位进行组织学观察。结果与模型组相比,各受试物均能够降低大鼠胃腺的出血损伤。低分子量胶原肽与高分子量胶原肽都能显著降低胃溃疡指数,胃溃疡抑制率分别为46.98%和46.46%(P<0.05);高剂量的胶原蛋白与中分子量胶原肽能极显著降低胃溃疡指数,胃溃疡抑制率分别为57.16%和65.16%(P<0.01)。结论鱼皮胶原蛋白及其酶解梯级多肽能够明显降低大鼠胃溃疡出血和溃疡指数,具有良好的抗酒精性胃溃疡作用。

关键词：鳕鱼胶原蛋白肽胃溃疡溃疡指数

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大丽轮枝菌侵染抗感棉种的组织学过程观察

植物病理学报 2014年第3期44卷 287-294页

作者：肖红利孔志强包郁明赵凤轩柳少燕李蕾陈捷胤戴小枫中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

棉花黄萎病是一种极难防治的土传性真菌病害，研究病原菌侵染棉花的组织学过程对致病机理解析和抗病资源利用具有重要意义。本研究利用绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌系统研究了其对抗病棉种海岛棉7124和三裂棉、感病棉种军棉1号和戴维... 详细信息

棉花黄萎病是一种极难防治的土传性真菌病害，研究病原菌侵染棉花的组织学过程对致病机理解析和抗病资源利用具有重要意义。本研究利用绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌系统研究了其对抗病棉种海岛棉7124和三裂棉、感病棉种军棉1号和戴维逊棉的侵染过程。结果表明，大丽轮枝菌对抗/感棉种的初始侵染没有明显差异，接菌5 h后，分生孢子均能吸附在感病和抗病棉种的根表面。但侵染过程存在显著差异，侵染感病棉种中病原菌3～5 d到达皮层，5～7 d达到维管束，随后迅速扩展繁殖，侵染14 d后即完成系统侵染，并开始产生黄萎病症状;而病原菌侵染抗病棉种，5～7 d才侵入皮层，7～10 d到达维管束，14 d后仍无法扩展，病原菌的定殖与发展受到限制，无法形成系统侵染，较少形成黄萎病症状。本研究通过绿色荧光蛋白标记大丽轮枝菌对抗/感棉种的侵染过程研究，为大丽轮枝菌致病机理研究和抗性资源利用提供了强有力的理论依据。

关键词：黄萎病大丽轮枝菌绿色荧光蛋白抗感棉花侵染过程

皱纹盘鲍脏器糖蛋白结构的初步鉴定及其免疫活性研究

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中国海洋药物 2012年第4期31卷 20-24页

作者：包郁明侯虎乔若瑾陶宇李志皓李八方中国海洋大学食品科学与工程学院山东青岛266003

目的分析鉴定皱纹盘鲍脏器糖蛋白AGP-Ⅲ初级结构并探讨脏器糖蛋白粗品AGP的免疫活性。方法采用高效液相色谱法、氨基酸组成分析法、红外光谱法、β-消除反应对AGP-Ⅲ进行初步分析;建立小鼠免疫低下模型,探讨AGP不同剂量对小鼠免疫功能... 详细信息

目的分析鉴定皱纹盘鲍脏器糖蛋白AGP-Ⅲ初级结构并探讨脏器糖蛋白粗品AGP的免疫活性。方法采用高效液相色谱法、氨基酸组成分析法、红外光谱法、β-消除反应对AGP-Ⅲ进行初步分析;建立小鼠免疫低下模型,探讨AGP不同剂量对小鼠免疫功能的调节作用。结果AGP-Ⅲ的单糖组成有岩藻糖、半乳糖、氨基葡萄、甘露糖、氨基半乳糖、木糖、葡萄糖和鼠李糖。AGP-Ⅲ含有17种氨基酸,缬氨酸含量最高,其次为谷氨酸、甘氨酸。AGP-Ⅲ中存在糖蛋白的特征吸收峰及β折叠结构,糖肽键类型为O-糖肽键,糖苷键类型为吡喃型。AGP中、高剂量组能显著提高免疫低下小鼠的细胞免疫和非特异性免疫功能。结论AGP-Ⅲ有糖蛋白的特征结构,AGP在适宜剂量条件下可提高小鼠的免疫能力。

关键词：皱纹盘鲍脏器糖蛋白结构免疫活性

植物致病真菌寄生类型与胞外糖基水解酶家族分析

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基因组学与应用生物学 2014年第3期33卷 640-648页

作者：陈相永陈捷胤李蕾包郁明孔志强戴小枫中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

植物致病真菌侵染寄主植株的过程中,会分泌特异的糖基水解酶至胞外,与寄主植物互作以完成其生活史。本研究利用已公布的基因组数据,注释并比较分析12种植物致病真菌胞外糖基水解酶(GH家族)与寄生类型之间的关系。结果表明,活体与非活体... 详细信息

植物致病真菌侵染寄主植株的过程中,会分泌特异的糖基水解酶至胞外,与寄主植物互作以完成其生活史。本研究利用已公布的基因组数据,注释并比较分析12种植物致病真菌胞外糖基水解酶(GH家族)与寄生类型之间的关系。结果表明,活体与非活体寄生真菌胞外GHs数量与亚家族分布有显著区别。其中参与细胞壁多糖降解的GHs在非活体寄生菌中显著扩增。进一步的系统发育分析显示GH3家族尤其在半活体寄生菌中扩增明显,这意味着植物致病真菌胞外GHs酶谱与病原菌寄生类型密切相关。据分析结果推测,GH 53、GH 61和GH 3亚家族的扩增有助于病原菌非活体寄生;GHs的丰度与多样化可能更有助于致病菌半活体寄生。

关键词：植物致病真菌寄生类型分泌蛋白生物信息学糖基水解酶

谷氨酸(钠)对人体肠道菌群影响的体外发酵研究

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生物技术通报 2020年第12期36卷 104-112页

作者：刘淑君陈苗王凤忠包郁明辛凤姣温博婷中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

为了研究谷氨酸对人体肠道微生物组成及功能的影响,以谷氨酸钠为底物进行肠道微生物的体外发酵,并测定发酵液中短链脂肪酸(SCFA)、γ-氨基丁酸(GABA)的含量。结果表明,添加谷氨酸钠的发酵液中总酸产量显著高于无底物添加的空白对照组(P<... 详细信息

为了研究谷氨酸对人体肠道微生物组成及功能的影响,以谷氨酸钠为底物进行肠道微生物的体外发酵,并测定发酵液中短链脂肪酸(SCFA)、γ-氨基丁酸(GABA)的含量。结果表明,添加谷氨酸钠的发酵液中总酸产量显著高于无底物添加的空白对照组(P<0.01),其中丁酸的含量增加了26倍;且体外发酵后,谷氨酸钠的转化率达72.36%。16S微生物多样性分析结果显示,与原始粪便样本相比,添加谷氨酸钠体外发酵后拟杆菌门(Bacteroidete)和变形菌门(Proteobateria)相对丰度升高(P<0.05),厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)相对丰度降低(P<0.01);添加谷氨酸钠显著提高了埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)和拟杆菌属(Bacteroides)的相对丰度(P<0.01)。研究表明,谷氨酸钠体外发酵可以提高发酵液中短链脂肪酸尤其是丁酸的产量,影响肠道微生物的组成结构及功能,并且谷氨酸钠可通过肠道微生物体外发酵转化生成GABA。

关键词：谷氨酸体外发酵肠道微生物 γ-氨基丁酸短链脂肪酸

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棉籽蛋白酶解物的制备及其抗菌活性

中国农业科学 2016年第15期49卷 3019-3029页

作者：韩晓燕包郁明辛凤姣孔志强 Christophe Blecker 戴小枫中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工重点实验室烈日大学食品学院

【目的】通过体外模拟动物胃肠道消化环境,对两种棉籽蛋白的酶解产物抗菌活性进行研究,为棉籽蛋白精深加工、高值化利用提供理论依据。【方法】以棉籽粕为原料,用Osborne法和传统的碱溶酸沉法分别制备棉籽蛋白(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋... 详细信息

【目的】通过体外模拟动物胃肠道消化环境,对两种棉籽蛋白的酶解产物抗菌活性进行研究,为棉籽蛋白精深加工、高值化利用提供理论依据。【方法】以棉籽粕为原料,用Osborne法和传统的碱溶酸沉法分别制备棉籽蛋白(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白)和棉籽分离蛋白(cottonseed protein isolate,CPI),用凯氏定氮法测定所得棉籽蛋白的蛋白含量,Tricine-SDS-PAGE测定蛋白亚基组成,通过扫描电镜观察蛋白的表面微观结构,选取蛋白含量较高的球蛋白(cottonseed globulin,CPG)和CPI进行研究。通过体外模拟动物胃肠道消化环境,用胃蛋白酶和胰蛋白酶依次对CPG和CPI进行酶解;以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为受试菌,分别以抗生素卡那霉素(Kanamycin,Kan)及未经酶解的蛋白溶液为对照,研究棉籽蛋白酶解产物的抗菌活性,同时用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测酶解产物中小肽的分子量大小及分布。【结果】碱溶酸沉法的提取率为(70.52±2.40)%,所得CPI的蛋白含量为(89.53±0.66)%;用Osborne法分别得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等4种棉籽蛋白,提取率为(67.55±1.16)%,其中CPG的蛋白含量最高为(82.57±1.02)%。Tricine-SDS-PAGE图谱表明CPG的亚基组成与CPI较接近;扫描电镜观察到的蛋白表面微观结构差别较大,CPI为颗粒大小较均匀整齐的蜂窝状结构,CPG由大小不均一的蛋白颗粒构成;相对于CPI,CPG中氨基酸保留较为完全。相同加酶量处理情况下,CPI的水解度高于CPG,且棉籽分离蛋白的小分子肽段(MW≤0.8 k Da)含量(70%—85%)显著高于棉籽球蛋白(40%—60%)。抗菌活性检测结果表明,当胃蛋白酶-胰蛋白酶加酶量为5 000—5 000 U时,两种蛋白酶解产物的抗菌能力最强,此时CPI和CPG的水解度分别为(24.72±1.07)%和(19.26±0.39)%,二者酶解产物对大肠杆菌的抑制能力均高于对金黄色葡萄球菌的抑制能力;CPI酶解产物的抗菌活性比CPG高,两者未经消化的蛋白溶液均无抗菌能力。通过分子量测定结果分析得到CPI酶解产物的抗菌活性物质的分子量在0.57—0.75 k Da,而CPG分子量分布在0.66—0.78 k Da。【结论】两种方法制备的蛋白在提取率方面没有显著差异(P>0.05),在亚基组成方面,Osborne法分级的蛋白间差异较大,但CPG和CPI组成较为相似;二者经体外模拟消化后的酶解产物均具有一定的抗菌活性,CPI酶解产物的抗菌活性高于CPG。

关键词：棉籽分离蛋白棉籽球蛋白体外模拟消化抗菌活性肽分子量分布