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烟草四种重要土传病原菌多重PCR检测方法的建立与应用

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植物病理学报 2023年第6期53卷 1208-1221页

作者：王荣波叶劲松吴平刘裴清林伟李本金福建省农业科学院植物保护研究所福建省作物有害生物监测与治理重点实验室福州350013 福建省烟草公司南平市公司南平353000

为快速准确地鉴定和区分烟草生产中的4种土传病害病原菌-青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、寄生疫霉(Phytophthora parasitica)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),通过设计和筛选特异性引物,建立多重PCR反应体系,并对体系中的引物用量和退火温度进行优化,检测优化后体系的特异性和灵敏度,验证其在烟草组织、土壤样品及种子样本中病原菌检测的实用性。结果表明,反应体系中最优的引物用量组合为RsRipNTF3/RsRipNTR3各0.9μL、PccTF4/PccTR4各0.6μL、PpRhTF1/PpRhTR1各1.2μL和FoP450TF1/FoP450TR1各0.8μL,最佳退火温度为61.1℃。该体系可分别扩增出4种病原菌的特异性片段,大小分别为511、361、669和840 bp,对病原菌DNA的检测灵敏度可达50 pg·μL^(-1)。植物组织和土壤样本检测结果表明,所建立的多重PCR检测方法能够准确地检测出其中的病原菌;采用该检测方法对80份烟草商品种进行检测,发现其中4个样本携带有青枯雷尔氏菌或尖孢镰刀菌,而未检测到软腐果胶杆菌和寄生疫霉。本研究建立的多重PCR检测方法可以灵敏、准确、高通量检测4种烟草土传病原菌,为烟草土传病害的准确诊断和早期防控提供可靠的技术方法。

关键词：烟草土传病害多重PCR 分子检测

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昼夜节律调控拟南芥核黄素信号传导

江苏农业科学 2010年第2期38卷 17-20页

作者：孙枫刘裴清董汉松南京农业大学农业部病虫害监测与治理重点开放实验室江苏南京210095

植物昼夜节律钟对调控植物生理进程、环境响应和发育起着重要作用。与此相似,核黄素信号途径广泛参与调控植物生长与发育。研究结果表明:在野生型拟南芥叶片中,内源黄素含量(核黄素、FMN、FAD)在24 h周期内呈节律波动;RT-PCR分析表明,... 详细信息

植物昼夜节律钟对调控植物生理进程、环境响应和发育起着重要作用。与此相似,核黄素信号途径广泛参与调控植物生长与发育。研究结果表明:在野生型拟南芥叶片中,内源黄素含量(核黄素、FMN、FAD)在24 h周期内呈节律波动;RT-PCR分析表明,外源核黄素处理植株增强或抑制许多基因的表达,这些基因在野生型植株24 h内的表达水平也受昼夜节律调控;此外,外源核黄素能诱导植物产生防卫反应,该过程也受昼夜节律调控。因此得出结论:植物昼夜节律钟调控核黄素信号传导反应。

关键词：拟南芥核黄素信号传导昼夜节律防卫反应

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荔枝霜疫霉自噬相关基因的鉴定与表达分析

植物病理学报 2022年第3期52卷 310-320页

作者：王荣波陈姝樽郭朦朦李文强刘裴清李本金翁启勇陈庆河福建省农业科学院植物保护研究所福建省作物有害生物监测与治理重点实验室福州350013 海南大学植物保护学院热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室海口570228

细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物中高度保守的胞内物质降解和循环再利用的生理过程,其调控细胞动态平衡、压力适应和细胞程序性死亡,与植物病原真菌生长发育、孢子形成、侵染等一系列过程密切相关。荔枝霜疫霉(Peronophythora litch... 详细信息

细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物中高度保守的胞内物质降解和循环再利用的生理过程,其调控细胞动态平衡、压力适应和细胞程序性死亡,与植物病原真菌生长发育、孢子形成、侵染等一系列过程密切相关。荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)侵染引起的荔枝霜疫病严重危害荔枝生产及采后贮藏。本研究利用模式物种中已知的自噬相关蛋白,采用同源比对的方法在荔枝霜疫霉基因组数据库中鉴定到19个同源蛋白,分属16种蛋白类型。分析基因结构和蛋白保守功能域,发现荔枝霜疫霉自噬相关基因均具有内含子,且数目差异明显;所鉴定候选蛋白都具有相应分组的保守功能域,而PlATG1a在C端具有2个额外的ATG11功能域,PlATG11则在其N端包含1个APG17功能域。进一步对具有核心功能且多成员的自噬相关蛋白ATG1、ATG6、ATG8和ATG18进行系统进化和序列模块分析发现,这些蛋白在不同物种之间十分保守,但是其同源蛋白间存在分化。通过转录组数据分析和qRT-PCR验证结果显示,荔枝霜疫霉中自噬相关基因在生长发育和侵染阶段均有表达,与菌丝阶段相比,PlATG1a、PlATG2、PlATG3、PlATG6a、PlATG8、PlATG18a基因在游动孢子阶段特异上调表达,其中PlATG8最为显著;PlVPS34在孢子囊阶段特异诱导表达,PlATG1b、PlATG12、PlATG17在孢子囊与游动孢子阶段上调表达但是在侵染阶段下调表达;PlATG6b、PlATG9、PlATG10、PlATG13、PlATG14及PlVPS15基因在生长发育和侵染阶段均表现出不同程度的上调表达,PlATG7、PlATG11、PlATG18b则在侵染阶段显著下调表达。结果表明,细胞自噬可能参与调控荔枝霜疫霉的生长发育及致病过程。

关键词：荔枝霜疫霉细胞自噬基因鉴定表达分析

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福建省部分马铃薯产区晚疫病菌群体结构研究

植物保护 2022年第1期48卷 104-109,115页

作者：李本金王荣波刘裴清邓丽霞石茗月李慧斌陈庆河福建省农业科学院植物保护研究所福建省作物有害生物监测与治理重点实验室福州350013 海南大学植物保护学院热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室海口570228

为明确福建省部分马铃薯产区晚疫病菌群体结构,2017年-2019年在龙海市、福安市、霞浦县共分离获得96株马铃薯晚疫病菌。采用对峙培养法、鉴别寄主法和PCR-RFLP法对这些菌株的交配型、生理小种及线粒体DNA(mtDNA)单倍型进行分析。交配型... 详细信息

为明确福建省部分马铃薯产区晚疫病菌群体结构,2017年-2019年在龙海市、福安市、霞浦县共分离获得96株马铃薯晚疫病菌。采用对峙培养法、鉴别寄主法和PCR-RFLP法对这些菌株的交配型、生理小种及线粒体DNA(mtDNA)单倍型进行分析。交配型测定结果显示,除了福建省福安市有5株(5.21%)为A1交配型外,其余91株(94.79%)均为自育型,未发现A2交配型及A1A2型菌株。从96个菌株中检测出16个生理小种类型,龙海市和福安市的优势生理小种均是可克服11个显性抗病单基因的1.***.3.4.5.***.7.8.9.10.11,霞浦县的优势生理小种为1.***.3.4.5.***.7.8.10。供试菌株均至少含有6个毒性基因。mtDNA单倍型共检测出3种类型,其中55个菌株(龙海市22株、福安市8株、霞浦县25株)为Ⅰa型,占57.29%,32个菌株(龙海市2株、福安市25株、霞浦县5株)为Ⅱa型,占33.33%,9个菌株(福安市7株、霞浦县2株)为Ⅱb型,占9.37%。研究结果表明,福建省马铃薯晚疫病菌群体遗传多样性日趋复杂。

关键词：马铃薯晚疫病菌交配型生理小种 mtDNA单倍型

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枯草芽胞杆菌BS193对辣椒疫霉的拮抗作用及其相关生防因子检测

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农业生物技术学报 2022年第4期30卷 772-782页

作者：王荣波陈姝樽肖小露李本金刘裴清石茗月陈庆河翁启勇福建省农业科学院植物保护研究所福建省作物有害生物监测与治理重点实验室海峡两岸特色作物安全生产省部共建协同创新中心福建农林大学

由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是一种毁灭性土传病害，在世界各大辣椒(Capsicum annuum)产区均有发生，严重威胁辣椒生产。本研究通过平板对峙法对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) BS193菌株的拮抗活性进行测定，结... 详细信息

由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是一种毁灭性土传病害，在世界各大辣椒(Capsicum annuum)产区均有发生，严重威胁辣椒生产。本研究通过平板对峙法对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) BS193菌株的拮抗活性进行测定，结果表明，其对6种植物病原卵菌具有显著抑制作用，其中对辣椒疫霉的抑制率达到66.70%。离体叶片接种实验结果显示，菌株BS193能够有效抑制辣椒疫霉菌的侵染，其防效达到63.50%；室内盆栽实验发现，菌液灌根浓度为1×108 cfu/mL、接种3 d时防病效果最好，高达89.52%。用20 mL浓度为1×108 cfu/mL的BS193菌株发酵液对辣椒幼苗灌根处理30 d后，其株高、根长、鲜重和干重分别增加48.16%～73.27%，表明BS193具有良好的促生作用。该菌株无菌发酵滤液能够抑制辣椒疫霉菌丝生长，导致菌丝分枝增多、畸形皱缩，并抑制孢子囊的产生、游动孢子释放及休止孢萌发，抑制率可达到90%以上。采用固体培养基培养和透明圈检测等方法检测BS193生防相关因子，发现其可以形成生物膜，并且具备产生蛋白酶和纤维素酶的能力。综上，菌株BS193对辣椒疫霉具有显著的拮抗活性，并具有良好的促生作用，本研究为辣椒疫病的有效防控提供了极具应用开发潜力的生防菌株。

关键词：枯草芽胞杆菌辣椒疫霉抑菌活性防效生防因子

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亚磷酸钾对马铃薯晚疫病病原菌的作用机理

植物保护学报 2018年第6期45卷 1389-1395页

作者：林敏王荣波陈庆河刘裴清李本金翁启勇福建省农业科学院植物保护研究所福建省作物有害生物监测与治理重点实验室福州350013 福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室福州350002

为明确亚磷酸钾对马铃薯晚疫病病原菌的作用机理,通过菌丝生长速率法和显微观察技术研究亚磷酸钾对马铃薯晚疫病病原菌菌丝生长和游动孢子释放的影响,并分别采用半定量反转录-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain re... 详细信息

为明确亚磷酸钾对马铃薯晚疫病病原菌的作用机理,通过菌丝生长速率法和显微观察技术研究亚磷酸钾对马铃薯晚疫病病原菌菌丝生长和游动孢子释放的影响,并分别采用半定量反转录-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及生物化学技术分析亚磷酸钾处理后马铃薯叶片防御基因表达、氧化酶活性以及可溶性蛋白含量的变化情况。结果表明,亚磷酸钾对马铃薯晚疫病病原菌菌丝生长和游动孢子释放均有明显的抑制作用,其抑制中浓度EC_(50)分别为24.03μg/mL和5.99μg/mL。接种晚疫病菌并经亚磷酸钾溶液处理的马铃薯叶片防御基因PR1、PR2表达量显著上调,接种8 d时表达量为银法利处理和清水对照的1.97～5.12倍;同时,过氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)酶活性增强,其峰值分别达534.29、281.13和68.84 U/mg,为银法利处理和清水对照的1.18～3.52倍;可溶性蛋白含量也随之增加,峰值(0.85 mg/mL)分别为银法利处理和清水对照的1.85倍和3.15倍。表明亚磷酸钾可通过直接抑菌作用和诱导植物产生抗病反应从而达到防治病害的目的。

关键词：亚磷酸钾晚疫病病原菌防御基因氧化酶活性可溶性蛋白含量

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辣椒疫霉菌产孢培养基及诱导方法筛选

热带作物学报 2013年第9期34卷 1776-1780页

作者：兰成忠刘裴清李本金陈庆河翁启勇福建省农业科学院植物保护研究所.福建福州350013

为筛选适合辣椒疫霉菌产孢的培养基和诱导方法。通过计算游动孢子数量,研究比较不同培养基和诱导方法对辣椒疫霉菌产生孢子囊数量的影响。研究结果显示:CA培养基最适合孢子囊的产生,孢子囊密度为5.68×102/cm2,其次为RA培养基,PDA、BA... 详细信息

为筛选适合辣椒疫霉菌产孢的培养基和诱导方法。通过计算游动孢子数量,研究比较不同培养基和诱导方法对辣椒疫霉菌产生孢子囊数量的影响。研究结果显示:CA培养基最适合孢子囊的产生,孢子囊密度为5.68×102/cm2,其次为RA培养基,PDA、BA和LA最不适合孢子囊的产生。采用创伤接种法,将辣椒疫霉菌菌丝体接种于20 d大小的黄瓜果实上,于28℃,24 h光照培养4 d后,黄瓜接种部位可产生病斑,病斑及周围产生密集菌丝,病斑上产生大量孢子囊,其产孢量为1.35×104/cm2,而同样接种方法的甜椒果实上所产生的孢子囊数量较少或不产生。不同诱导方法比较显示,日光照射受伤菌丝所产生的孢子囊数量高于菌丝块水培法。研究结果表明,CA培养基、创伤接种黄瓜果实和日光照射受伤菌丝适宜辣椒疫霉菌孢子囊的产生。

关键词：辣椒辣椒疫霉菌孢子囊产孢

荔枝霜疫霉巢式PCR和LAMP检测方法的建立

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农业生物技术学报 2016年第6期24卷 919-927页

作者：李本金刘裴清刘小丽黄宏臻翁启勇陈庆河福建省农业科学院植物保护研究所/福建省农作物害虫监测与综合治理重点实验室福建农林大学闽台特色作物病虫生态防控协同创新中心

由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)引起的荔枝霜疫霉病是荔枝(Litchi chinensis)生产上的重要病害,建立霜疫霉快速准确检测方法,对于该病的早期诊断和及时防控至关重要。本研究以荔枝霜疫霉三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(GTP-binding... 详细信息

由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)引起的荔枝霜疫霉病是荔枝(Litchi chinensis)生产上的重要病害,建立霜疫霉快速准确检测方法,对于该病的早期诊断和及时防控至关重要。本研究以荔枝霜疫霉三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(GTP-binding protein gene,Ypt1)为靶序列,设计特异性引物,建立了巢式PCR和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)两种检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。特异性检测表明,只有不同来源的21个荔枝霜疫霉菌株经PCR扩增获得249 bp的特异性条带,同时,在钙黄绿素指示剂的作用下,LAMP检测显示绿色,且扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳出现特有的梯形条带,而其他13种不同卵菌近缘种及8种常见病原真菌42个菌株均未观察到这些现象。灵敏度检测显示,将特异引物Pv YF1/Pv YR1与疫霉属Ypt1通用引物Yph1F/Yph2R进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达100 fg/25μL,较常规PCR提高1 000倍,而LAMP方法检测灵敏度是巢式PCR的10倍。本研究分别采用常规PCR、巢式PCR和LAMP方法对采集自福建省荔枝霜疫霉病典型症状及可疑症状的荔枝叶片或果实进行检测,并用传统分离方法进行验证。结果表明,在漳州采集的30份样品中,常规PCR、巢式PCR和LAMP方法的阳性检出率分别为17/22(77.3%)、20/22(90.9%)和21/22(95.5%);在莆田采集的25份样品中,常规PCR、巢式PCR和LAMP方法的阳性检出率分别为15/17(88.2%)、16/17(94.1%)、17/17(100%)。可见LAMP方法明显提高了检测效率,并且具有检测程序便捷,所需设备简单和肉眼能判断结果的优势,适合基层部门及田间荔枝霜疫霉快速检测。

关键词：荔枝霜疫霉三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1) 巢式PCR 环介导等温扩增技术(LAMP) 分子检测

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豇豆疫霉LAMP检测方法的建立

植物保护 2018年第4期44卷 119-124页

作者：李本金刘小丽刘裴清王荣波翁启勇陈庆河福建省农业科学院植物保护研究所福建省作物有害生物监测与治理重点实验室福州350013 福建农林大学、闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室福州350002

本研究以豇豆疫霉Phytophthora vignae Purss核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为靶标片段,设计4条特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法。特异性检测结果表明:8株不同地理来源的豇豆疫霉菌株LAMP检... 详细信息

本研究以豇豆疫霉Phytophthora vignae Purss核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为靶标片段,设计4条特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法。特异性检测结果表明:8株不同地理来源的豇豆疫霉菌株LAMP检测均为阳性(绿色),扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳出现特有的梯形条带,而其他11种卵菌近缘种及12种常见病原真菌和细菌共42个菌株均未观察到这些现象。灵敏度分析显示:该方法检测灵敏度在DNA水平上可达到100fg/25μL。采用LAMP方法对福建建瓯和宁德采集的62份疑似豇豆疫病病株样本进行检测,并用组织分离方法进行验证。结果表明,LAMP和组织分离方法的检出率分别为67.7%(42/62)和61.3%(38/62)。综合以上结果,LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、快速高效、操作简单的特点,适合基层部门用于田间豇豆疫霉快速检测。

关键词：豇豆疫霉内转录间隔区(ITS) 环介导等温扩增技术(LAMP) 分子检测