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CRISPR/Cas9技术构建干扰素受体敲除细胞系及其应用

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CRISPR/Cas9技术构建干扰素受体敲除细胞系及其应用

作者：刘欣奕甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的本研究利用CRISPR/Cas9技术构建干扰素受体敲除细胞系,旨在研究IFNAR1基因敲除后对干扰素受体功能的影响,为探寻宿主细胞内干扰素抗病毒的机制以及提高轮状病毒感染滴度搭建技术平台,为后续相关研究提供有力保障。方法1、根据规律... 详细信息

目的本研究利用CRISPR/Cas9技术构建干扰素受体敲除细胞系,旨在研究IFNAR1基因敲除后对干扰素受体功能的影响,为探寻宿主细胞内干扰素抗病毒的机制以及提高轮状病毒感染滴度搭建技术平台,为后续相关研究提供有力保障。方法1、根据规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins 9,CRISPR/Cas9)技术原理,设计特异性识别Ⅰ型干扰素受体亚单位1(interferon alpha and beta receptor subunit1,IFNAR1)基因外显子区的sgRNA(single guide RNA)序列,构建Lenti CRISPRv2-IFNAR1-sgRNA重组质粒,慢病毒包装后感染Caco-2细胞,嘌呤霉素抗性筛选,有限稀释法培养单克隆细胞系。通过靶基因测序和Western Blot验证IFNAR1基因敲除情况。2、通过加入外源性IFN-β检测IFNAR1基因敲除后细胞CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand-10,CXCL10)、干扰素刺激基因20(interferon-stimulated gene 20,ISG20)、干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)、干扰素诱导蛋白3(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3,IFIT3)和粘液病毒抗性蛋白1(myxovirus resistance protein 1,MX1)等干扰素激活分子的m RNA水平。3、通过q RT-PCR法测定野生型caco-2细胞中H组轮状病毒(Rotavirus H,RVH)J19滴度,通过间接免疫荧光实验验证野生型caco-2细胞中J19的VP6蛋白表达,通过干扰素刺激后q RT-PCR法测定J19滴度。4、通过q RT-PCR法比较IFNAR1敲除Caco-2细胞株和野生型caco-2细胞中J19感染后病毒基因复制情况。结果1、获得两株IFNAR1基因敲除单克隆细胞。基因测序结果显示,其中,Caco-2-IFNAR1-KO1的IFNAR1第六个外显子发生了5 bp缺失,Caco-2-IFNAR1-KO2的第七个外显子发生了18 bp缺失同时有1 bp增加;Western Blot结果显示,与野生型Caco-2细胞相比,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞IFNAR1蛋白未见表达。2、相比于0 ng/ml,在50 ng/ml外源IFN-β刺激下敲除细胞的CXCL10基因、ISG15基因、ISG20基因、IFIT3基因和MX1基因的m RNA表达水平没有明显升高;与野生型Caco-2细胞比较,在50 ng/ml外源IFN-β刺激下敲除细胞的CXCL10基因、ISG15基因、ISG20基因、IFIT3基因和MX1基因的m RNA表达水平显著性降低。3、H组轮状病毒J19和A组轮状病毒G6P1能够在野生型Caco-2细胞中复制和表达VP6蛋白。同时,干扰素刺激后野生型Caco-2细胞中轮状病毒J19滴度明显下降。4、与野生型Caco-2细胞比较,RVH感染IFNAR1敲除Caco-2细胞株后,病毒复制增高;但是在目前的实验条件下,没有显著性差异。结论Caco-2细胞可以很好作为轮状病毒复制和细胞内干扰素抗病毒研究的宿主细胞,利用CRISPR/Cas9技术成功获得了IFNAR1敲除的Caco-2细胞株。该细胞系依赖Ⅰ型干扰素受体激活的下游分子被明显抑制,初步探讨轮状病毒感染Caco-2细胞后复制情况,为后续深入研究轮状病毒的感染机制、干扰素通路抗病毒机制以及提高病毒培养效率,探寻制约轮状病毒培养的关键因素提供了平台。

关键词：人结肠腺癌细胞 Ⅰ型干扰素受体轮状病毒基因编辑

基于完善工程项目建设全过程咨询服务工作的思考

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工程造价管理 2022年第6期 92-95页

作者：刘欣奕内蒙古自治区呼伦贝尔市住房和城乡建设事业发展中心内蒙古呼伦贝尔021008

为进一步完善工程管理机构的组织模式,树立集成化管理服务的理念,国务院办公厅于2017年提出《关于促进建筑业持续健康发展的意见》,国家发展改革委、住房和城乡建设部2019年提出《关于推进全过程工程咨询服务发展的指导意见》,对工程建... 详细信息

为进一步完善工程管理机构的组织模式,树立集成化管理服务的理念,国务院办公厅于2017年提出《关于促进建筑业持续健康发展的意见》,国家发展改革委、住房和城乡建设部2019年提出《关于推进全过程工程咨询服务发展的指导意见》,对工程建设管理模式改革起到了积极的指导作用,但目前全过程咨询服务机构的地位不清晰、经费来源不明确等问题依然阻碍工程建设管理模式改革的顺利开展。文章结合工程建设管理实践,对推行全过程咨询服务工作中存在的问题进行了探讨,提出了全过程咨询服务机构与项目单位或代建机构的关系及服务工作的性质、完善其资质认证,以及明确项目管理费用的合法来源的改革思路,对推行全过程咨询服务工作提出了积极的建议。

关键词：建设项目管理费用全过程咨询服务

基于CRISPR/Cas9系统Ⅰ型干扰素受体亚单位1基因敲除的Caco-2细胞系的构建

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中国生物制品学杂志 2023年第2期36卷 145-150,157页

作者：刘欣奕安妮章青王宏孔翔羽王铭月庞立丽段招军甘肃中医药大学公共卫生学院甘肃兰州730000 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室北京102206 中国医学科学院医药生物技术研究所北京100050

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统在人结肠腺癌细胞Caco-2中敲除Ⅰ型干扰素受体亚单位1(interferon alpha/beta receptor subunit 1,IFNAR1)基因,构建IFNAR1基因敲除Caco-2细胞系。方法利用CRISPR/Cas9技术设计特异性识别IFNAR1基因外显子区的sgRNA(single guide RNA)序列,构建LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA重组质粒,慢病毒包装后感染Caco-2细胞,嘌呤霉素抗性筛选,有限稀释法培养单克隆细胞系。通过靶基因测序和Western blot法验证IFNAR1基因敲除情况;通过加入外源性IFNβ检测IFNAR1基因敲除细胞CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)和干扰素刺激基因20(interferon-stimulatd gene 20,ISG20)mRNA水平。结果质粒LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA测序结果显示插入位置均位于BsmBⅠ酶切黏性末端。共获得2株IFNAR1基因敲除单克隆细胞株,测序结果显示Caco-2-IFNAR1-KO1的IFNAR1第6个外显子发生5 bp缺失,Caco-2-IFNAR1-KO2的第7个外显子发生18 bp缺失,同时有1 bp增加。与野生型Caco-2细胞相比,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞IFNAR1蛋白未见表达。相比于0 ng/mL IFNβ,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为0.566和1.268,P>0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为1.522和1.733,P>0.05)均无明显升高;与野生型Caco-2细胞相比,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为6.763和6.777,P<0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为5.664和5.653,P<0.05)均显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功获得了IFNAR1基因敲除的Caco-2细胞株,该细胞系依赖Ⅰ型IFN受体(interferon alpha/beta receptor,IFNAR)激活的下游分子被明显抑制,为进一步探讨病毒感染Caco-2细胞后的天然免疫反应及复制包装机制提供了有力的工具。

关键词：人结肠腺癌细胞 CRISPR/Cas9系统 Ⅰ型干扰素受体亚单位1基因基因编辑干扰素β CXC趋化因子配体10 干扰素刺激基因20

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新型双盘磁齿整流发电机结构及运行特性

中南大学学报（自然科学版） 2024年第3期55卷 951-962页

作者：常智斌刘欣天津工业大学机械工程学院天津市现代机电装备技术重点实验室天津300387

为了实现波浪能的采集与高效转换,加快波浪能开发利用,提出一种新型双盘磁齿整流发电机(double disk magnetic tooth rectifier generator,DDMTRG)。首先,介绍发电机的结构特点和整流原理,结合盘式转子和磁齿轮工作特点分析其结构参数;... 详细信息

为了实现波浪能的采集与高效转换,加快波浪能开发利用,提出一种新型双盘磁齿整流发电机(double disk magnetic tooth rectifier generator,DDMTRG)。首先,介绍发电机的结构特点和整流原理,结合盘式转子和磁齿轮工作特点分析其结构参数;其次,采用气隙比磁导法及有限元仿真分析该发电机的空载电磁特性和负载输出特性;第三,基于矩角特性分析磁齿轮的带载能力,由外定子各典型位置磁密特征解析该发电机铜耗和铁耗;最后,讨论外定子、盘式转子和磁齿轮结构参数对该发电机运行特性的影响规律。研究结果表明:该电机可将浮子的上下浮动转换为发电机单一方向的旋转运动,实现了波浪运动的整流,效率在94%左右,能量利用率较高;空载气隙磁密和电动势波形正弦性较优,计算结果基本吻合;磁齿轮结构参数对该发电机运行特性影响较大,当盘式转子外圆周永磁体极弧系数为0.6,厚度为4.5 mm,气隙长度为0.5 mm,轴向长度为100 mm,磁齿轮半径为35 mm,长度为40 mm,磁齿轮外圆周永磁体厚度为4 mm,极弧系数为0.8时,双盘磁齿整流发电机的性能较优,发电效率较高,磁齿轮带载能力较强。

关键词：波浪能双盘发电机磁齿整流运行特性矩角特性效率

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循环老化三元锂离子电池热失控气体毒性研究

北京航空航天大学学报 2024年第6期50卷 1761-1769页

作者：张青松曲奕润中国民航大学民航热灾害防控与应急重点实验室天津300300

为研究高能量密度锂离子电池循环老化过程中热失控特性变化及释放气体的毒性危害,对不同循环老化程度的三元锂离子电池进行热滥用实验,利用气体传感器阵列,基于有效剂量分数模型对热失控气体毒性危害进行定量分析。结果表明,高镍含量三... 详细信息

为研究高能量密度锂离子电池循环老化过程中热失控特性变化及释放气体的毒性危害,对不同循环老化程度的三元锂离子电池进行热滥用实验,利用气体传感器阵列,基于有效剂量分数模型对热失控气体毒性危害进行定量分析。结果表明,高镍含量三元锂离子电池循环性能差,200次循环老化后,电池健康状态低于70%。老化电池更容易进入热失控状态,热失控反应更剧烈但释放能量少,释放气体燃烧效率低。在密闭空间内,电池热失控释放窒息性气体危害性比刺激性气体更高,150次循环老化电池的窒息性气体毒性累积效应比新鲜电池早638 s达到临界值1。随老化程度增加,最终电池的刺激性气体毒性即时效应与气体致死毒性即时效应降低,与新鲜电池相比,100次循环老化后,电池的刺激性气体毒性即时效应降低0.34,气体致死毒性即时效应降低0.19。研究结果可为老化电池安全性评估及热失控预警提供数据支撑。

关键词：三元锂离子电池热失控循环老化气体传感器阵列气体毒性分析

引入ESO的永磁超环面电机无模型预测电流控制

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北京航空航天大学学报 2024年第4期50卷 1085-1096页

作者：刘欣王正阳王晓远天津工业大学天津市现代机电装备技术重点实验室天津300387 天津大学电气自动化与信息工程学院天津300072

为改善无差拍预测电流控制(DPCC)对永磁超环面电机系统参数的依赖性,研究了引入扩张状态观测器(ESO)的永磁超环面电机无模型预测电流控制(MFPCC-ESO)策略。根据永磁超环面电机的复合转子结构,引入自转运动影响系数与磁势系数,在旋转坐... 详细信息

为改善无差拍预测电流控制(DPCC)对永磁超环面电机系统参数的依赖性,研究了引入扩张状态观测器(ESO)的永磁超环面电机无模型预测电流控制(MFPCC-ESO)策略。根据永磁超环面电机的复合转子结构,引入自转运动影响系数与磁势系数,在旋转坐标系下建立该电机的时变数学模型;利用永磁超环面电机系统的输入与输出,建立该电机具有时变比例因子的超局部模型,同时引入ESO对超局部模型的干扰部分进行实时估计,并利用朱利稳定判据证明了ESO的稳定性;结合延时补偿的DPCC预测得到参考电压矢量,从而实现永磁超环面电机的MFPCC-ESO策略。对参数匹配和失配下永磁超环面电机MFPCC-ESO策略与DPCC策略进行对比分析,仿真结果表明:MFPCC-ESO策略下的永磁超环面电机具有优越的动态和稳态性能及强鲁棒性,同时该控制策略还能有效降低永磁超环面电机的输出波动。

关键词：超环面电机超局部模型无模型预测电流控制扩张状态观测器

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数字化转型、人力资本与企业全要素生产率

统计与决策 2024年第14期40卷 167-172页

作者：曹爱军刘欣甘肃政法大学商学院兰州730070 桃源县三阳港镇人民政府湖南常德415000

文章以我国沪深A股制造业上市公司2016—2020年的数据为样本,实证检验了数字化转型对企业全要素生产率的影响及其传导机制。研究发现:数字化转型可显著提高企业全要素生产率,该结论在考虑内生性问题以及进行一系列稳健性检验后仍然成立... 详细信息

文章以我国沪深A股制造业上市公司2016—2020年的数据为样本,实证检验了数字化转型对企业全要素生产率的影响及其传导机制。研究发现:数字化转型可显著提高企业全要素生产率,该结论在考虑内生性问题以及进行一系列稳健性检验后仍然成立,否定了数字化转型的生产率悖论;提升人力资本水平是数字化转型提高企业全要素生产率的重要路径;数字化转型对企业全要素生产率的促进效果因企业产权性质、企业规模、市场竞争程度、知识产权保护度不同而存在差异。

关键词：制造业数字化转型全要素生产率人力资本

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房繄恭针灸治疗盆腔淤血综合征临床经验

中国针灸 2024年

作者：刘欣房繄恭中国中医科学院针灸研究所中国中医科学院针灸医院

介绍房繄恭教授针刺治疗盆腔淤血综合征的临床经验。房繄恭教授认为本病病机为冲任瘀阻，气血运行不畅，胞宫经血流通受阻。临证治疗谨守病机，重调冲任，总结出“立足冲任，化瘀止痛”“腧穴所在，主治所在”“安神定志，身心同调”的... 详细信息

介绍房繄恭教授针刺治疗盆腔淤血综合征的临床经验。房繄恭教授认为本病病机为冲任瘀阻，气血运行不畅，胞宫经血流通受阻。临证治疗谨守病机，重调冲任，总结出“立足冲任，化瘀止痛”“腧穴所在，主治所在”“安神定志，身心同调”的治疗思路，选用百会、神庭、本神、中脘、天枢、关元、大赫、子宫为主穴，并根据病因、症状灵活配穴，针刺过程中重视应用逍遥调神针法，以及医患双方治神守神，为治疗盆腔淤血综合征提供新思路。

关键词：盆腔淤血综合征盆腔静脉曲张慢性盆腔痛针灸房繄恭

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空中交通CPS结构特性及韧性评估

北京航空航天大学学报 2024年第4期50卷 1187-1196页

作者：王兴隆魏奕雯贺敏中国民航大学空中交通管理学院天津300300

针对空中交通体系结构复杂、耦合性强、脆弱性高的特点,为缓解因受扰导致的级联失效现象,对其结构韧性进行研究。建立了空中交通信息物理系统(CPS)模型,提出同层度与层间度、同层介数与层间介数等指标,分析级联失效过程;提出空中交通CP... 详细信息

针对空中交通体系结构复杂、耦合性强、脆弱性高的特点,为缓解因受扰导致的级联失效现象,对其结构韧性进行研究。建立了空中交通信息物理系统(CPS)模型,提出同层度与层间度、同层介数与层间介数等指标,分析级联失效过程;提出空中交通CPS韧性的概念,并采用定量评估方法对受损能力和恢复能力进行度量;对比不同扰动-恢复策略下的空中交通CPS表现,制定最佳恢复策略,提高受扰时的韧性。以华东地区空中交通CPS为例进行分析,结果表明:空中交通CPS网络度分布服从幂率分布,介数服从指数分布;在基于介数度值扰动下,采用介数恢复策略可以有效提高受扰时空中交通CPS的韧性。

关键词：信息物理系统级联失效扇区网络航路网络空中交通CPS韧性