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大熊猫犬冠状病毒S基因的扩增、克隆和序列分析

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大熊猫犬冠状病毒S基因的扩增、克隆和序列分析

作者：关振宏吉林农业大学

学位级别：硕士

1997年5月，重庆动物园3只大熊猫发病，经强心，补液和抗菌消炎等治疗措施，收效甚微，于6月22日两只26岁的大熊猫死亡。胡桂学等人利用犬肾传代细胞对送检的死亡大熊猫肝、脾等病料进行了病毒的分离和鉴定研究，结果成功地分离获得了1... 详细信息

1997年5月，重庆动物园3只大熊猫发病，经强心，补液和抗菌消炎等治疗措施，收效甚微，于6月22日两只26岁的大熊猫死亡。胡桂学等人利用犬肾传代细胞对送检的死亡大熊猫肝、脾等病料进行了病毒的分离和鉴定研究，结果成功地分离获得了1株病毒(命名为DXMV)。电镜负染检查细胞培养物，见有冠状病毒样粒子。为进一步鉴定，胡等人利用能扩增出11种冠状病毒的简并核苷酸引物进行RT-PCR扩增，结果证明该病毒是冠状病毒属中的一员。根据国外已发表的CCV-K378株的S基因序列设计了一对引物，扩增出了1086bp的目的基因片段(S基因第81-1166位)，通过基因的序列测定和分析比较，证明了该株病毒为犬冠状病毒(CCV)。本研究是在完成大熊猫肝脏分离病毒的鉴定的基础之上，对CCVDXMV的S基因其它部分进行基因扩增、克隆和序列测定，并与其它CCV株的S基因序列进行同源性分析。犬冠状病毒只有一个血清型，但不同地区和动物来源的毒株在毒力和分子生物学方面不尽相同。病毒基因的克隆和序列测定是分析病毒遗传特征的最佳方法。CCV的S基因所编码的S蛋白是病毒最大的结构蛋白，由1452个氨基酸组成(Insavc-1株)，是病毒粒子中较保守的蛋白质。病毒进入机体后，首先接触到的就是S蛋白，其作用是与细胞受体结合，引起细胞融合，刺激机体产生中和抗体和细胞介导的细胞毒成分。因此S蛋白是CCV致病力和宿主特异性的主要决定因子，但目前有关犬冠状病毒S蛋白和基因的变异研究报道较少。本研究以测定该株CCV的S基因序列为主要研究内容，目的在于研究其分子生物学特征，探讨其S基因与其它株的差异，从而为犬冠状病毒病的基因工程疫苗研究提供科学依据，也为大熊猫的病毒性疾病的防治奠定基础。由于CCV的S基因很大，一次扩增整个基因的难度很大。该株病毒是新分离古林农业大学硕士学位论文大熊猫犬冠状病毒s墓因的扩增、克隆和序列分析的ccv毒株，病毒滴度低，增加了RT一PcR的难度。所以本实验设计了半套式PcR引物分段扩增s基因。根据GeneBank中发表的ccv K378株基因序列，利用软件Primer Premiers .0共设计了六条引物(sFZ一sRZ，sF3一sR，，sR工3，sF工，)，其中sF:一sRZ扩增出了792bP的基因片段;sF3一sR，为外层的半套式引物，sR工3、sF工3分别为内层的半套式引物，分别扩增出了737bP和1178bP的基因片段。同时根据ccv工n。av。一i株基因序列设计了引物sF:一sR:，sF。一sR。和sP工.。sF:一sR:扩增368bp的片段，sP。一sR.和sFI‘用于套式扩增985bP的基因片段。将各部分的PcR产物纯化，并分别克隆入PGEM一T载体中，用PcR和限制酶酶切两种方法鉴定重组质粒，然后将阳性重组菌送生物公司测序。5个s基因片段合并起来囊括了s基因的81一1 166位以外的全部序列，序列用生物软件编辑除去各部分重复序列和引物序列，得到s基因的全部序列。将eev DxMV的s基因序列和其它eev毒株、Te卿卿2 002和F工Pv 79一11连6的s基因序列用DNAStar和DNAsi。作多重比较，并绘制了进化树。核普酸序列分析比较表明，该病毒与ccv NvsL和K378株的同源性最高，可达到9 9 .5%;而与eev 23/03的同源性最低，为56 .9急;与F工四和TGEv分别有90.理龟和52 .1龟的同源性。DxMV与K3 78、eev6、eev v54、FxPv79一1146、TGEv姗2002和eCv 23/03的氨基酸序列同源性分别为:99.0龟、97.1龟、96.1龟、92.7龟、81.3%和50.0%。本研究对大熊猫分离的犬冠状病毒的部分s基因进行了克隆和序列分析，为大熊猫的疾病防治工作提供了必要的信息和资料，同时也丰富了犬冠状病毒的分子生物学研究内容。

关键词：大熊猫犬冠状病毒 S基因克隆序列分析

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改进的单相脉冲整流器模型预测电流控制策略

电网技术 2020年第5期44卷 1845-1851页

作者：宋智威黄路熊成林关振宏西南交通大学电气工程学院四川省成都市610031

传统的模型预测算法中给定值与实际值存在静态误差,这是由模型预测控制算法的基本原理决定的。针对该问题,首先该文基于内模原理推导了比例积分的补偿环节,并对模型预测电流控制中给定电流进行修正,实现给定值与实际值的无静差跟踪。其... 详细信息

传统的模型预测算法中给定值与实际值存在静态误差,这是由模型预测控制算法的基本原理决定的。针对该问题,首先该文基于内模原理推导了比例积分的补偿环节,并对模型预测电流控制中给定电流进行修正,实现给定值与实际值的无静差跟踪。其次,为了避免网压畸变对锁相环的相位检测造成影响,提出一种基于相位偏移补偿的电压信号检测方法,并将其用于模型预测电流控制算法。实验表明,所提补偿环节能改善模型预测的静态跟踪性能;相位检测方法能有效地检测网压基波相位信息,证明所提方法的正确性和有效性。

关键词：单相脉冲整流器 PI补偿静态误差相位检测

基于双重补偿相位检测方法在单相脉冲整流器中的应用

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电网技术 2020年第10期44卷 3983-3990页

作者：宋智威黄路熊成林关振宏西南交通大学电气工程学院四川省成都市610031

为解决传统锁相环方法存在的缺陷,有学者提出基于参考频率的无锁相环同步相位检测方法。但该方法存在着电压频率与参考频率不匹配时会产生相位偏移,频率波动时动态响应较慢等问题。为解决上述问题,该文提出一种双重补偿相位检测方法,该... 详细信息

为解决传统锁相环方法存在的缺陷,有学者提出基于参考频率的无锁相环同步相位检测方法。但该方法存在着电压频率与参考频率不匹配时会产生相位偏移,频率波动时动态响应较慢等问题。为解决上述问题,该文提出一种双重补偿相位检测方法,该方法利用单相电网电压,无需锁相环便可获得与电网电压的同步信号。针对无锁相环中控制器给定参考频率与电网频率不匹配时,会造成电网相位检测产生相位偏移的情况,引入相位补偿策略;同时为了提高相位检测的动态响应,通过引入q轴电压闭环反馈,实时校准补偿信号。最后,通过建立单相脉冲整流器模型预测数学模型,实验对比了所提算法和未补偿前的无锁相环算法,证明了该算法的有效性和正确性。

关键词：单相脉冲整流器无锁相环双重补偿电压反馈

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基于数学推导的级联多电平逆变器性能研究

电气传动 2009年第10期39卷 42-46页

作者：唐顺关振宏磁浮技术与磁浮列车教育部重点实验室四川成都610031

载波相移SPWM技术应用于级联型多电平逆变器,可以达到提高等效开关频率,改善输出性能的效果。而载波相移角度差π/N和2π/N两种移相方式,对不同级联数目的逆变器输出有不同影响。当三相逆变器中功率单元发生故障被切除后,输出电压不再... 详细信息

载波相移SPWM技术应用于级联型多电平逆变器,可以达到提高等效开关频率,改善输出性能的效果。而载波相移角度差π/N和2π/N两种移相方式,对不同级联数目的逆变器输出有不同影响。当三相逆变器中功率单元发生故障被切除后,输出电压不再平衡。而利用中性点偏移技术,可使逆变器输出线电压重新达到平衡,从而具备较好的容错能力。通过对载波相移PWM技术和中性点偏移原理的数学推导,得出采用载波相移角π/N方式与中性点偏移技术,逆变器输出性能有较大提高的结论。最后对级联型9电平逆变器A相中某一功率单元故障后状况进行仿真实验,验证了数学推导的正确性。

关键词：载波相移正弦脉冲调制中性点偏移级联型多电平逆变器容错

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新型单/三相变流器的研究

机车电传动 1997年第1期 32-34页

作者：关振宏钮小明连级三西南交通大学

提出了一种新型静止单／三相变流器，即由单相交流电源和单相逆变器构成的“Ｖ”型供电电源。该变流器采用ＭＣＳ－８０９８单片机作为控制器，ＧＴＯ作为功率开关器件。给出了系统的硬件和软件结构设计，并对逆变器输出电压进行了电流... 详细信息

提出了一种新型静止单／三相变流器，即由单相交流电源和单相逆变器构成的“Ｖ”型供电电源。该变流器采用ＭＣＳ－８０９８单片机作为控制器，ＧＴＯ作为功率开关器件。给出了系统的硬件和软件结构设计，并对逆变器输出电压进行了电流追踪型的ＳＰＷＭ调制。理论分析和实验结果表明，这是一种中等性能的变流器。

关键词：微机结构设计电力机车三相变流器

免疫共沉淀筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白相互作用的蛋白

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微生物学报 2009年第8期49卷 1081-1085页

作者：李耀东关振宏严景华中国科学院微生物研究所北京100101 中国科学院研究生院北京100049 吉林大学畜牧兽医学院北京130062

【目的】筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白(A/M2)相互作用的蛋白质。【方法】将A/M2编码序列插入真核表达载体pCAGGS-CFlag,重组质粒pCAGGS-CFlag-A/M2转染HEK-293T细胞,裂解细胞,以Flag单抗偶联的琼脂糖球珠免疫沉淀A/M2-Flag蛋白,清洗... 详细信息

【目的】筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白(A/M2)相互作用的蛋白质。【方法】将A/M2编码序列插入真核表达载体pCAGGS-CFlag,重组质粒pCAGGS-CFlag-A/M2转染HEK-293T细胞,裂解细胞,以Flag单抗偶联的琼脂糖球珠免疫沉淀A/M2-Flag蛋白,清洗去除非特异性结合的杂蛋白后,SDS-PAGE银染法显示与A/M2共沉淀的蛋白,从胶上切下此蛋白条带进行质谱分析。【结果】成功构建了A/M2的表达质粒,免疫印迹证实了A/M2蛋白在293T细胞中能够表达,免疫共沉淀筛选到与A/M2结合的多种蛋白,分析质谱结果,确定ataxin 10和3个真核翻译起始因子(eIF)为候选蛋白。【结论】ataxin 10与A/M2相互作用为流感病毒感染或接种流感疫苗引发小脑性共济失调提供了解释,eIF与A/M2相互作用表明A/M2可能在调控病毒蛋白合成方面起重要作用。

关键词：免疫共沉淀 A型流感病毒M2蛋白质谱蛋白相互作用

双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)的真核表达、纯化及鉴定

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安徽农业科学 2009年第28期37卷 13521-13523页

作者：关振宏李影张茂林段铭吉林大学人兽共患病教育部重点实验室人兽共患病研究所吉林长春130062 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118

[目的]获得真核表达的Flag-PKR融合蛋白,以用于流感病毒相关的PKR信号通路调控机制研究。[方法]以RT-PCR方法扩增PKR目的基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0-Flag中。将所构建的重组质粒pcDNA3.0-Flag-PKR转染293T细胞,利用Flag抗体... 详细信息

[目的]获得真核表达的Flag-PKR融合蛋白,以用于流感病毒相关的PKR信号通路调控机制研究。[方法]以RT-PCR方法扩增PKR目的基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0-Flag中。将所构建的重组质粒pcDNA3.0-Flag-PKR转染293T细胞,利用Flag抗体偶联的琼脂糖凝胶(anti-Flag M2-Agarose)纯化Flag-PKR融合蛋白,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及体外活性鉴定。[结果]重组质粒转染293T细胞,Western blot显示表达出的融合蛋白能够被抗Flag的抗体特异性识别,其相对分子量约为69 kDa,与Flag-PKR融合蛋白大小相符;体外磷酸化试验表明,Flag-PKR融合蛋白能够发生自动磷酸化。[结论]在293T细胞中表达、纯化了有活性的Flag-PKR融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础。

关键词：流感病毒双链RNA依赖的蛋白激酶真核表达纯化

流感病毒在诱导A549细胞凋亡过程中对MDM2和p53蛋白的影响

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中国兽医学报 2009年第1期29卷 12-14,24页

作者：段铭张茂林关振宏吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病教育部重点实验室吉林长春130062

采用Hoechst 33258染色和流式细胞术观察了流感病毒诱导A549细胞凋亡的情况,同时应用Western-blot方法研究了MDM2和p53等蛋白表达的情况。结果表明,100 TCID50/0.1 mL剂量病毒感染A549细胞后,细胞表现出典型的凋亡特征,死亡细胞比例随... 详细信息

采用Hoechst 33258染色和流式细胞术观察了流感病毒诱导A549细胞凋亡的情况,同时应用Western-blot方法研究了MDM2和p53等蛋白表达的情况。结果表明,100 TCID50/0.1 mL剂量病毒感染A549细胞后,细胞表现出典型的凋亡特征,死亡细胞比例随感染进程逐渐增加。在流感病毒诱导细胞凋亡过程中,MDM2蛋白表达下降,p53和p-p53表达上升,其下游p21蛋白也被激活。可见,p53及其下游p21蛋白参与了流感病毒诱导的A549细胞凋亡,同时通过下调MDM2蛋白表达促进了p53蛋白诱导的细胞凋亡。

关键词：流感病毒凋亡 MDM2蛋白 p53蛋白

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狂犬病病毒糖蛋白信号肽序列分析

吉林农业大学学报 2013年第3期35卷 346-350,354页

作者：乔斌段铭关振宏栾维民钱爱东张茂林人兽共患病研究教育部重点实验室吉林大学人兽共患病研究所长春130062 吉林大学动物医学学院长春130062 吉林农业大学动物科学技术学院长春130118

为比较不同狂犬病病毒株糖蛋白信号肽序列的差异,测定了2株固定毒（CVS、3aG株）及2株街毒（SX、PB3）的糖蛋白核苷酸序列,并推导了氨基酸序列。DNAstar软件分析表明：2株街毒糖蛋白信号肽同源性为100%,2株固定毒株同源性为84.2%,街毒株... 详细信息

为比较不同狂犬病病毒株糖蛋白信号肽序列的差异,测定了2株固定毒（CVS、3aG株）及2株街毒（SX、PB3）的糖蛋白核苷酸序列,并推导了氨基酸序列。DNAstar软件分析表明：2株街毒糖蛋白信号肽同源性为100%,2株固定毒株同源性为84.2%,街毒株与CVS、3aG的同源性分别为78.9%和73.7%;2株街毒的信号肽序列与NCBI收录的我国近年来分离的街毒株的序列完全相同;街毒株与常用疫苗株间的同源性介于68.4%~84.2%,疫苗株PV与SRV9、PV与ERA、PV与SAG同源性均为100%。对糖蛋白信号肽疏水区（-15位到-4位）的二级结构预测和疏水值计算显示,街毒株信号肽的二级结构和疏水值均与常用疫苗株和固定株存在明显差异;在N2A细胞上效价测定显示,2株街毒的效价明显低于2株固定毒。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白信号肽街毒株疏水区