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应用SMART cDNA合成技术富集鸡脾脏微量RNA

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动物医学进展 2009年第3期30卷 6-9页

作者：兰道亮岳华汤承西南民族大学生命科学与技术学院四川成都610041

以鸡脾脏中提取的20ng微量RNA为起始样本,应用SMART cDNA合成技术合成cDNA第一链及扩增第二链,并在原有基础上做了适当的优化和改进。同时与传统cDNA合成方法进行了比较。最终,从20ng总RNA中成功扩增出双链cDNA6.03μg,而采用传统方法... 详细信息

以鸡脾脏中提取的20ng微量RNA为起始样本,应用SMART cDNA合成技术合成cDNA第一链及扩增第二链,并在原有基础上做了适当的优化和改进。同时与传统cDNA合成方法进行了比较。最终,从20ng总RNA中成功扩增出双链cDNA6.03μg,而采用传统方法只合成出0.03μg cDNA,且前者cDNA的质量和纯度明显高于后者。结果表明,通过SMART cDNA合成技术,可使鸡脾脏微量RNA得到有效地富集。

关键词： SMART cDNA合成技术脾脏鸡

牦牛β-防御素5基因的原核表达及表达产物的抑菌活性

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2014年第10期42卷 22-28,34页

作者：符梅熊显荣兰道亮李键西南民族大学生命科学与技术学院动物遗传育种重点实验室四川成都610041

【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基... 详细信息

【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET32a-BNBD5。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃进行诱导表达,SDSPAGE检测融合蛋白的表达情况,并对该重组蛋白进行纯化,测定其体外抑菌活性。【结果】克隆得到了BNBD5基因成熟肽编码片段,其长度为138bp,编码45个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因序列与黄牛的mRNA同源性最高,可达到86.2%。经IPTG诱导,获得了分子质量为25ku的牦牛β防御素-5成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散结果表明,0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有抗菌作用。【结论】牦牛BNBD5成熟肽在大肠杆菌中得到了成功表达,其产物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抗性。

关键词：牦牛 β-防御素5 重组蛋白抑菌活性

16S rRNA高通量测序技术筛选牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及菌群结构

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中国农业科学 2017年第5期50卷 932-941页

作者：杨琦玥黄勇陈亚冰刘洛川李键兰道亮西南民族大学生命科学与技术学院西南民族大学青藏高原研究院

【目的】确定理想的牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及初步分析牦牛瘤胃细菌的群体结构。【方法】采用物理法(珠磨法、反复冻融法)、化学法(CTAB、SDS)及酶解法(溶菌酶、蛋白酶K)三者与瘤胃细菌特点相结合的方法,组合生成9种不同方法,即... 详细信息

【目的】确定理想的牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及初步分析牦牛瘤胃细菌的群体结构。【方法】采用物理法(珠磨法、反复冻融法)、化学法(CTAB、SDS)及酶解法(溶菌酶、蛋白酶K)三者与瘤胃细菌特点相结合的方法,组合生成9种不同方法,即方法 1(CTAB+SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 2(CTAB+SDS+Lysozyme+反复冻融法)、方法 3(CTAB+SDS+Lysozyme+珠磨法)、方法 4(CTAB+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 5(CTAB+Lysozyme+反复冻融法)、方法 6(CTAB+Lysozyme+珠磨法)、方法 7(SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 8(SDS+Lysozyme+反复冻融法)、方法 9(SDS+Lysozyme+珠磨法),同时以QIA amp DNA Stool Mini Kit(方法 10)为对照,以这10种方法来提取瘤胃微生物基因组DNA,并通过DNA浓度、纯度、DNA电泳图等基本性质及16S r RNA高通量测序结果对其进行分析比较,同时通过测序结果初步分析牦牛瘤胃细菌群体结构。【结果】不同DNA提取方法效率比对结果显示,同样的化学及生物酶裂解条件下,结合珠磨法及反复冻融法能够显著地增强细胞裂解效率,提高DNA产量。其中方法 3及方法 6提取的DNA具有较高的浓度及纯度,方法 7—10缺乏CTAB阳离子去污剂,提取的DNA量显著低于其他方法(P<0.05),除方法 2和8所提取的样品经多次试验,PCR产物目的条带太弱或未检测到外,其余8种方法提取的样品PCR产物目的条带大小正确,浓度合适,符合高通量测序的要求。16S r RNA高通量测序共生成了191 349条原始数据,质控后得到有效序列171 231条。稀释性曲线分析表明,数据量合理并达到饱和,能够完整反映样品的菌群种类。OTU聚类数据统计、分类学和多样性指数分析显示方法 6和10包含的细菌较丰富。不同提取方法对革兰氏阳性菌提取效果比对结果表明方法 6裂解革兰氏阳性菌细胞壁的能力比其他方法相对较高。综上,方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨)提取的DNA产量、样品多样性指数及革兰氏阳性菌破壁能力均优于其他方法。菌群结构分析表明牦牛瘤胃细菌菌群结构包括21门、35纲、75科、112属,丰度较高的菌群依次是拟杆菌Bacteroidtes(64%)、厚壁菌Firmicutes(20%)、螺旋体Spirochaetae(2.3%)和变形菌Proteobacteri(1.8%),纤维杆菌Fibrobacter(1.7%)。牦牛瘤胃细菌群体结构与黄牛相比存在着一定的差异,这可能归因于饮食及环境的不同。【结论】利用16S r RNA高通量测序筛选出了牦牛瘤胃细菌基因组DNA理想提取方法,即方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨),并初步分析了牦牛瘤胃细菌群体结构,为研究牦牛瘤胃微生物群体特殊性及挖掘牦牛体内的基因资源奠定了基础。

关键词：牦牛瘤胃微生物 DNA 提取方法菌群结构

基于RNA-Seq高通量测序技术的牦牛卵巢转录组研究:进一步完善牦牛基因结构及挖掘与繁殖相关新基因

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中国科学：生命科学 2014年第3期44卷 307-317页

作者：兰道亮熊显荣位艳丽徐通钟金城字向东王永李键西南民族大学青藏高原研究院成都610041 西南民族大学生命科学与技术学院成都610041 深圳华大基因研究院深圳518083

RNA—Seq作为近年来新发展起来的高通量转录组测序技术，为大规模转录组学研究提供了一种全新的且更为有效的方法．目前该技术已广泛应用于转录组学中多方面的研究，尤其近年来，该技术在进一步完善基因结构信息及挖掘新转录本及新基因... 详细信息

RNA—Seq作为近年来新发展起来的高通量转录组测序技术，为大规模转录组学研究提供了一种全新的且更为有效的方法．目前该技术已广泛应用于转录组学中多方面的研究，尤其近年来，该技术在进一步完善基因结构信息及挖掘新转录本及新基因方面的功能也逐渐受到关注．本研究以牦牛卵巢组织作为研究对象，应用***技术对其进行高通量转录组测序分析，经测序后得到了一个包含26826516条过滤后测序读数，4828772880bp的卵巢测序文库，比对分析显示，有16992条牦牛基因发生表达，其中3734条基因存在不同类型的可变剪接．功能分析表明，这些表达基因涉及多种GO分类及KEGG通路．进一步分析转录组数据发现，共有7340个基因的5’或3’端在原有基因组的位置基础上发生了延伸，同时还发现了6321个新转录本，定位回基因组预测显示，外显子数量为1～84个，其中2267个新转录本预测具有编码蛋白的能力．比对分析显示，共有1200～4993条新转录本分别与Nt数据库、Nr数据库及SwissProt数据库中的基因比对上，其中与牛相似性基因最多（41．4％），其次为野牦牛（33．0％）、绵羊（6．3％）、人类（2．8％）及小鼠（1．6％）等其他物种．进一步对新转录本进行GO分类注释，结果显示，与繁殖发育相关的GO分类占有较大比例，其中繁殖类别（reproduction）所涉及的新转录本最多．本研究结果为描绘牦牛卵巢正常转录组图谱及进一步探析牦牛繁殖性能提供了基础，同时证实***高通量转录组技术在完善基因结构及挖掘新转录本及新基因方面的具有强大的优势，为进一步完善牦牛基因组结构信息及挖掘潜在的新基因提供了丰富数据．

关键词：牦牛卵巢转录组 RNA—Seq 基因结构新基因

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牦牛生态养殖与产业发展措施

四川畜牧兽医 2015年第3期42卷 13-14页

作者：李解兰道亮李键西南民族大学生命科学与技术学院四川成都610041

牦牛肉作为绿色食品，富含蛋白质、氨基酸以及多种微量元素，对提高民众体质，完善营养结构有着至关重要的作用，牦牛相关产品在其他行业也得到认可。同时牦牛产业的合理发展也有利于高原地区农牧民经济收入增长，是解决西部高原地区产... 详细信息

牦牛肉作为绿色食品，富含蛋白质、氨基酸以及多种微量元素，对提高民众体质，完善营养结构有着至关重要的作用，牦牛相关产品在其他行业也得到认可。同时牦牛产业的合理发展也有利于高原地区农牧民经济收入增长，是解决西部高原地区产业不丰富，农牧民收入来源不稳定的有力之举。

关键词：牦牛肉产业生态养殖农牧民收入高原地区绿色食品微量元素营养结构

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单细胞转录组测序技术及在哺乳动物上的应用

生物技术通报 2022年第11期38卷 41-48页

作者：寇佳怡王玉玲曾睿琳兰道亮西南民族大学青藏高原研究院成都610041 西南民族大学畜牧兽医学院成都610041 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室成都610041

哺乳动物的器官是由多种细胞类型组成,它们通过细胞间的相互作用来发出信号,以维持体内平衡和确保机体发育。传统转录组测序是以大量细胞或组织为研究样本,反映的是细胞总体上转录组特征,不能分析单个细胞的基因表达情况,而单细胞RNA测... 详细信息

哺乳动物的器官是由多种细胞类型组成,它们通过细胞间的相互作用来发出信号,以维持体内平衡和确保机体发育。传统转录组测序是以大量细胞或组织为研究样本,反映的是细胞总体上转录组特征,不能分析单个细胞的基因表达情况,而单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术的发展为揭示单个细胞转录组特征提供了有效方法。本文通过对scRNA-seq平台、scRNA-seq主要技术类型及scRNA-seq在哺乳动物上的应用展开综述。

关键词：单细胞转录组测序哺乳动物细胞类型异质性

IMPDH基因克隆、生物信息学分析及在牦牛卵巢不同时期中的差异表达

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西北农业学报 2017年第6期26卷 812-819页

作者：熊显荣兰道亮胡嘉嘉李键字向东西南民族大学生命科学与技术学院成都610041 西南民族大学青藏高原研究院成都610041

旨在获得牦牛IMPDH基因序列并进行生物信息学分析,同时分析其在卵巢组织中的时序表达谱,为进一步研究卵巢生长发育及排卵机制奠定基础。通过RT-PCR技术克隆牦牛的IMPDH基因,并运用生物信息学方法分析不同物种序列进化关系,利用荧光定量q... 详细信息

旨在获得牦牛IMPDH基因序列并进行生物信息学分析,同时分析其在卵巢组织中的时序表达谱,为进一步研究卵巢生长发育及排卵机制奠定基础。通过RT-PCR技术克隆牦牛的IMPDH基因,并运用生物信息学方法分析不同物种序列进化关系,利用荧光定量qRT-PCR技术检测IMPDH基因在不同发育时期牦牛卵巢组织中的表达情况。结果显示,克隆得到牦牛1 623bp的IMPDH基因cDNA序列,内含1 545bp开放阅读框序列,编码514个氨基酸残基。与野牦牛的相应序列具有很高的同源性(99.4%),表明IMPDH基因在进化过程中相对保守。实时定量RT-PCR检测结果显示IMPDH基因的表达随年龄的增加而呈现上升趋势。荧光定量qRT-PCR检测结果显示IMPDH基因在卵巢卵泡期表达最强,显著高于红体形成期。结果表明IMPDH参与牦牛卵巢组织的生长发育,并在卵巢活动中有明显的表达规律,表明IMPDH基因在牦牛繁殖周期具有重要作用,为进一步研究牦牛IMPDH基因功能奠定基础。

关键词：牦牛克隆 IMPDH 序列分析差异表达

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转录组测序及其在反刍动物中的应用研究进展

中国畜牧杂志 2023年第6期59卷 75-81页

作者：杨玉霞吉文汇付伟兰道亮西南民族大学畜牧兽医学院四川成都610041 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室四川成都610041

近年来,随着下一代测序技术的快速发展和成本降低,转录组测序(RNA-seq)已经成为一种全面而准确的基因表达模式分析工具。反刍动物,尤其是牛羊等具备较高的经济价值,因此,研究反刍动物的转录组测序具有重要意义。本文介绍了RNA-seq技术... 详细信息

近年来,随着下一代测序技术的快速发展和成本降低,转录组测序(RNA-seq)已经成为一种全面而准确的基因表达模式分析工具。反刍动物,尤其是牛羊等具备较高的经济价值,因此,研究反刍动物的转录组测序具有重要意义。本文介绍了RNA-seq技术及其在反刍动物应用中的最新研究进展,为反刍动物基因组学研究提供参考依据。

关键词：转录组 RNA-seq 反刍动物应用

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牛诱导多能干细胞的建立及应用研究进展

生物技术通报 2023年第5期39卷 130-141页

作者：曾虹曾睿琳付伟吉文汇兰道亮西南民族大学畜牧兽医学院成都610041 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室成都610041 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室成都610041

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为可以无限增殖更新并具有分化为三胚层多种细胞类型的一类干细胞系。目前对人与小鼠的iPSCs研究已经取得了很多重要成果,... 详细信息

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为可以无限增殖更新并具有分化为三胚层多种细胞类型的一类干细胞系。目前对人与小鼠的iPSCs研究已经取得了很多重要成果,但其他动物,如牛等经济型有蹄类家畜iPSCs的研究始终没有突破性的进展。如何将外源转录因子通过重编程载体高效安全地导入体细胞中并持续表达是生产牛诱导多能干细胞(bovine induced pluripotent stem cells,biPSCs)的主要瓶颈。本文就biPSCs建立中重编程系统的选择、诱导因子的选择、小分子化合物的添加等方面进行综述,以期为进一步完善biPSCs及牛胚胎干细胞系的建立提供参考。

关键词：牛诱导多能干细胞体细胞重编程培养体系小分子化合物