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Ⅰ群禽腺病毒多种血清型的致病性和Hexon、Fiber基因序列分析及其抗体交叉中和试验

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Ⅰ群禽腺病毒多种血清型的致病性和Hexon、Fiber基因序列分析及其...

作者：傅禹铭佛山科学技术学院

学位级别：硕士

禽腺病毒(Fowl Adenovirus,Fadv)自1987年首次爆发以来迅速传播全球,对家禽养殖业造成重大损失。禽腺病毒可根据病毒基因结构与序列长短分为三个群:Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群。目前危害我国家禽养殖业禽腺病毒以Ⅰ群为主。I群禽腺病毒又可根据... 详细信息

禽腺病毒(Fowl Adenovirus,Fadv)自1987年首次爆发以来迅速传播全球,对家禽养殖业造成重大损失。禽腺病毒可根据病毒基因结构与序列长短分为三个群:Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群。目前危害我国家禽养殖业禽腺病毒以Ⅰ群为主。I群禽腺病毒又可根据血清型分为12个,经过长期的流行病学调查研究发现对以陆生禽类养殖为主的养殖企业或者散养户Fadv-4、Fadv-8a、Fadv-8b、Fadv-11这四种血清型最为普遍。本研究旨在研究禽腺病毒分离株致病性及血清交叉保护作用为后续疫苗研制提供数据支持。本研究涉及从2014～2020年间实验室保存Ⅰ群Fadv分离株进行分子生物学鉴定,确定各个分离株血清型。结果为:5株4型分离株(GDDL-4、GDHQY-4、GDLHX-4、GDZMY-4、GDZYQ-4);2株8型分离株(GDB3-8a、GDT08-8b);2株11型分离株(GDWYT-11、GDZWJ-11)共9株。随后对各个血清型分离株Hexon基因与Fiber基因遗传演化分析,结果为GDDL-4、GDHQY-4、GDLHX-4、GDZMY-4、GDZYQ-4分离株与Fadv-4参考序列(Gen Bank:MG856954.1)同源性90%～100%;GDB3-8a、GDT08-8b分离株与Fadv-8参考序列(Gen Bank:KT862810.1)同源性97.1%～97.5%;GDWYT-11、GDZWJ-11分离株与Fadv-11参考序列(Gen Bank:KT862816.1)同源性97.4%～97.9%,各个分离株均包含多个氨基酸位点突变;根据遗传演化分析可知,本研究中涉及血清4型分离株Hexon、Fiber基因源自国内演变而来。针对目标分离株(GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11)设计不同的特异性荧光定量引物,成功建立针对三种血清型的I群禽腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法。结果为Fadv-4标准曲线:y=-3.5237x+44.979,相关系数R=0.9987,扩增效率E=91.89%;Fadv-8标准曲线:y=-3.387x+44.038,相关系数R=0.9993,扩增效率E=97.62%;Fadv-11标准曲线:y=-3.673x+48.257,相关系数R=0.9966,扩增效率E=86%;构建经过测试均表现出良好特异性、敏感度和稳定性。下一步,为探究分离株(GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11)的致病性在鸡胚、鸭胚和LMH细胞上的差异进行攻毒实验。结果显示分离株对鸡胚、鸭胚致病性较弱,接种后未见死胚,尿囊液澄清,胚体无异常变化;而研究发现其对LMH细胞致病性较强,可导致细胞在第5代时出现严重CPE;目标分离株感染细胞后48～60 h可达到峰值滴度,其中以GDWYT-11在LMH细胞上增殖效率更高。TCID显示目标分离株均具有良好的病毒滴度,预示本次研究选择的病毒株更适宜在细胞中生长。为探究目标分离株(GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11)致病性对10日龄SPF雏鸡的影响,本次实验设立GDDL-4组、GDB3-8a组、GDT08-8b组、GDWYT-11组、阴性对照组,选择腿部肌肉注射接种10TCID/0.2 m L病毒液。观察SPF雏鸡死亡情况、剖检病变。结果显示四株目标毒株均可导致严重心包积液-包涵体肝炎综合征,GDDL-4组症状最为严重,病死率最高可达85%,总体死亡率在0～85%之间。排毒分析结果为目标分离株均可导致病鸡反复排毒,GDDL-4组、GDB3-8a组出现大滴度排毒(≥10000 copies/μL),GDT08-8b组、GDWYT-11组仅能检测到低滴度(≤1000 copies/μL)排毒。病毒载量分析结果显示,目标分离株均有广泛亲嗜性,在肝脏与肠道病毒载量最高。随后的交叉中和试验结果显示Fadv-4血清能够中和Fadv-11病毒,Fadv-8a之间Fadv-8b不能产生交叉中和作用,Fadv-8b血清能和Fadv-11病毒产生中和,预示血清型之间的交叉保护作用复杂,交叉保护作用较差。总结,本研究通过对Fadv分离株进行分子生物学分析、研究其对鸡胚、细胞与动物致病性试验,结合血清交叉中和试验的结果,得出以下结论(1)Ⅰ禽腺病毒分离株(GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11)更适宜LMH细胞作病毒分离培养;(2)GDDL-4株对10日龄雏鸡致病力最强(死亡率高达85%);(3)血清型之间的交叉保护作用复杂,交叉保护力较弱。

关键词：禽腺病毒序列分析荧光定量交叉中和致病性

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泡沫轻质土在陈海公路提升改造工程中的应用

智能城市 2021年第1期7卷 22-24页

作者：傅禹铭中交一航局第一工程有限公司天津300456

在传统高速公路的扩建和改造工程中,台背路堤填料存在施工后桥头跳车、不均匀沉降、结构物断裂等病害,增加了公路营运后的维修、养护费用。泡沫轻质土具有密度小、质量轻、强度大于常规回填土、填筑后形成一个整体、抗冲击性能好、无侧... 详细信息

在传统高速公路的扩建和改造工程中,台背路堤填料存在施工后桥头跳车、不均匀沉降、结构物断裂等病害,增加了公路营运后的维修、养护费用。泡沫轻质土具有密度小、质量轻、强度大于常规回填土、填筑后形成一个整体、抗冲击性能好、无侧向压力、对地基荷载小等优势。文章结合工程实例介绍泡沫轻质土在桥台背填充中的应用。

关键词：一级公路提升改造泡沫轻质土

4株Ⅰ亚群禽腺病毒分离株对SPF雏鸡的致病性研究

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中国畜牧兽医 2022年第3期49卷 1032-1040页

作者：谢梓民曾繁聪傅禹铭姜含雨杨惠湖柯骏鸿罗瑞梁昭平张雪莲黄淑坚佛山科学技术学院生命科学与工程学院佛山528225 广州华南农大生物药品有限公司广州510000

【目的】探究Ⅰ亚群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)分离株GDDL-4(FAdV-4)、GDB3-8a(FAdV-8a)、GDT08-8b(FAdV-8b)、GDWYT-11(FAdV-11)对SPF雏鸡的致病性,进而制定更加有效的防控措施。【方法】设立4个攻毒组(GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11)及对照组,攻毒组选择腿部肌内注射接种0.2 mL 105 TCID50病毒液,对照组接种等体积PBS。接种后观察SPF雏鸡的临床症状、剖检病变及组织病理学变化,同时检测其排毒量和病毒载量。【结果】所有攻毒组鸡均表现为精神沉郁、消瘦、扎堆等,病理剖检以严重心包积液-包涵体肝炎综合征病变为主,其中GDDL-4组症状最为严重,死亡率最高达85%,总体死亡率在0~85%之间。排毒分析结果发现,GDDL-4和GDB3-8a组出现高滴度排毒(≥104拷贝/μL),GDT08-8b和GDWYT-11组仅能检测到低滴度(≤103拷贝/μL)排毒。器官指数表明,除GDT08-8b组与对照组无明显差异外,其余攻毒组均能造成器官不同程度的肿大或萎缩。病理组织学切片显示,肝脏、肾脏、法氏囊的正常结构被破坏,可见肝细胞有大量淋巴细胞浸润、肾间质充血出血、法氏囊淋巴细胞坏死等。病毒载量分析结果显示,GDDL-4与GDWYT-11组在肝脏组织中病毒滴度最高,而GDB3-8a与GDT08-8b组在十二指肠中病毒滴度最高。【结论】Ⅰ亚群FAdV的死亡率高,4株分离株均可导致雏鸡肝脏出现包涵体肝炎的病理变化,均可反复排毒,且分离株对不同的组织器官有不同的亲嗜性,在肝脏与十二指肠等组织中的病毒载量最高。

关键词：禽腺病毒(FAdV) SPF雏鸡剖检病变组织病理学排毒量病毒载量

Ⅰ群禽腺病毒多种血清型的Hexon、Fiber基因遗传进化分析

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黑龙江畜牧兽医 2022年第17期 92-98页

作者：姜含雨柯骏鸿谢梓民杨惠湖傅禹铭曾繁聪梁昭平方文棋张雪莲黄淑坚佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528231 华南农业大学兽医学院广州510642 广东容大生物股份有限公司广东南海528231

为了进一步丰富和完善广东地区禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)的分子流行病学,试验采用PCR及基因克隆测序技术对2014—2020年期间瑞普(天津)生物药业有限公司分离保存的9株Ⅰ群FAdV分离株进行分子生物学鉴定,并通过MEGA 5.1软件对各分... 详细信息

为了进一步丰富和完善广东地区禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)的分子流行病学,试验采用PCR及基因克隆测序技术对2014—2020年期间瑞普(天津)生物药业有限公司分离保存的9株Ⅰ群FAdV分离株进行分子生物学鉴定,并通过MEGA 5.1软件对各分离株的Hexon与Fiber进行遗传演化分析。结果表明:9株Ⅰ群FAdV分离株中有5株4型分离株,分别为GDDL-4、GDHQY-4、GDLHX-4、GDZMY-4、GDZYQ-4;2株8型分离株,分别为GDB3-8a和GDT08-8b;2株11型分离株,分别为GDWYT-11和GDZWJ-11。分离株GDDL-4、GDHQY-4、GDLHX-4、GDZMY-4、GDZYQ-4与FAdV-4型国内参考株GDMZ(GenBank登录号MG856954.1)的同源性为99.9%~100%;分离株GDB3-8a、GDT08-8b与FAdV-8a英国参考株764(GenBank登录号KT862811.1)的同源性为97.1%~97.7%;分离株GDB3-8a、GDT08-8b与FAdV-8b日本参考株TR59(GenBank登录号KT862810.1)的同源性为97.0%~97.5%;分离株GDWYT-11、GDZWJ-11与FAdV-11型英国参考株380(GenBank登录号为KT862812.1)的同源性为97.4%~97.9%。各分离株均包含多个氨基酸位点突变。分离株GDDL-4、GDHQY-4、GDLHX-4、GDZMY-4、GDZYQ-4的Hexon、Fiber与国内部分参考株同源性较高、亲缘性更近;分离株GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11、GDZWJ-11的Hexon、Fiber与国外部分参考株同源性较高,遗传距离更近。说明分离株GDDL-4、GDHQY-4、GDLHX-4、GDZMY-4、GDZYQ-4由国内毒株演变而来,分离株GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11、GDZWJ-11则由国外毒株演变而来。

关键词：禽腺病毒基因分型氨基酸同源性分析遗传进化

不同途径感染“安卡拉病毒”雏鸡的病理变化比较

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不同途径感染“安卡拉病毒”雏鸡的病理变化比较

中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学...

作者：傅禹铭李智丽佛山科学技术学院

引言安卡拉病毒病是由禽腺病毒血清型4型(FAdV-4)感染而导致家禽发生心包积液、肝脏出血充血、肺脏出血水肿等病变的一种高死亡率的疫病,又称为心包积水-肝炎综合征。因其在巴基斯坦安卡拉附近的地方被发现,所以被称为"安卡拉病"。本病...

引言安卡拉病毒病是由禽腺病毒血清型4型(FAdV-4)感染而导致家禽发生心包积液、肝脏出血充血、肺脏出血水肿等病变的一种高死亡率的疫病,又称为心包积水-肝炎综合征。因其在巴基斯坦安卡拉附近的地方被发现,所以被称为"安卡拉病"。本病在我国呈散在性发生,首次大量发病在山东聊城地区,主要发生在肉鸡中,随后在河南、辽宁、河北、江苏及湖北等地区均出现该症状疫情报道,死

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一例禽白血病的诊断

黑龙江畜牧兽医 2019年第12期 64-66,165-166页

作者：王美红黄雯晶李文锋傅禹铭李晓文郭锦玥张雪莲黄淑坚李智丽佛山科学技术学院生命科学与工程学院

为了对广东某麻黄种鸡场疑似禽白血病的患鸡进行确诊,试验采用了剖检、反转录PCR(RTPCR)、病理组织切片观察等方法进行诊断。结果表明:患鸡剖检可见皮下、心脏、肾脏、肺脏、胰腺均出现不同程度的灰白色肿瘤结节,肝脏、脾脏、肾脏严重肿... 详细信息

为了对广东某麻黄种鸡场疑似禽白血病的患鸡进行确诊,试验采用了剖检、反转录PCR(RTPCR)、病理组织切片观察等方法进行诊断。结果表明:患鸡剖检可见皮下、心脏、肾脏、肺脏、胰腺均出现不同程度的灰白色肿瘤结节,肝脏、脾脏、肾脏严重肿大,质地变硬,颜色变淡;随机收集该场5只疑似病鸡的病料进行PCR检测,4只病鸡的病料可扩增出目的条带;采集病鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、气管、肾脏、脑、肠进行病理组织切片观察,内脏器官和软骨组织的骨化部分中含有数量不等的髓细胞样瘤细胞,呈单个散在或局灶样分布,大脑有单个散在的髓细胞样瘤细胞出现,小脑组织轻度水肿。综合以上结果确诊该鸡场病鸡所患疾病为禽白血病。

关键词：麻黄种鸡禽白血病临床病变 RT-PCR 病理组织切片鉴别诊断

肠道中药对实验小鼠肠道乳酸菌和抗病能力的影响

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中国兽医杂志 2019年第10期55卷 96-99,I0008页

作者：陆英杰傅禹铭方焕新汤诗婷李文峰黄淑坚佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东南海528231

为了研究肠道中药即肠痢康对小鼠肠道乳酸菌和抗病能力的影响,取32只SPF级BALB/c雄性小鼠,随机平均分为2组:对照组和试验组。试验组按照药量浓度计算进行饮水供给,空白组小鼠自由采食饮水,记录小鼠每天采食量,计算料肉比;酯酶染色法检... 详细信息

为了研究肠道中药即肠痢康对小鼠肠道乳酸菌和抗病能力的影响,取32只SPF级BALB/c雄性小鼠,随机平均分为2组:对照组和试验组。试验组按照药量浓度计算进行饮水供给,空白组小鼠自由采食饮水,记录小鼠每天采食量,计算料肉比;酯酶染色法检测试验第1周,2周,3周,4周的T、B淋巴细胞比值的动态变化;1个月后,将对照组和试验组中各8只小鼠进行致病性葡萄球菌的攻毒试验,观察小鼠发病后即全部处死,ELISA检测小鼠血清中的IgM和C3,生化方法检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT);采集小鼠肝脏和脾脏进行常规病理学染色,同时无菌进行乳酸菌的检测。结果显示,试验组的料肉比数值明显小于对照组(P<0.05),显示对小鼠生长有显著性促进作用;试验组T、B细胞比值高于对照组,差异显著(P<0.05);攻毒后,中药试验组的IgM明显高于对照组,差异显著(P<0.05),AST和ALT的含量显著低于对照组;常规染色方法观察对照组的肝脏和脾脏损伤程度明显高于药物试验组,显示中药试验组对肝脏具有保护作用,提高免疫功能。

关键词： SPF小鼠肠道中药乳酸菌免疫功能抗病能力

2011-2017年我国华南地区新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)流行株σB蛋白基因遗传变异分析

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2011-2017年我国华南地区新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)流行株σB蛋白基...

中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学...

作者：李文锋黄淑坚李智丽黄雯晶李晓文傅禹铭佛山科学技术学院生命科学与工程学院

引言鸭源呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)感染后引起水禽免疫器官坏死或萎缩等病变,是严重危害水禽养殖业健康发展的重要免疫抑制性病毒。DRV临床上主要以番鸭呼肠孤病毒(Muscovyduck reovirus,MDRV)和新型鸭呼肠孤病毒(New-type duck re...

引言鸭源呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)感染后引起水禽免疫器官坏死或萎缩等病变,是严重危害水禽养殖业健康发展的重要免疫抑制性病毒。DRV临床上主要以番鸭呼肠孤病毒(Muscovyduck reovirus,MDRV)和新型鸭呼肠孤病毒(New-type duck reovirus,NDRV)为主。国内近五年流行病学调查数据显示病死鸭中DRV的阳性率为39.55%～45.2%,各个品种鸭均可发生,发病鸭日龄愈小,其

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一株鸭疫里默氏杆菌分离鉴定及药敏试验

广东畜牧兽医科技 2019年第5期44卷 38-40页

作者：黄美玲李文锋李晓文黄雯晶傅禹铭李文俊黄淑坚湛江市动物疫苗供应站广东湛江524000 佛山科学技术学院动物医学系广东佛山528231

本试验从病死鸭中分离出一株疑似鸭疫里默氏杆菌的病原菌.经形态学观察、生化试验、培养特性鉴定、16SrRNA检测,确定其为鸭疫里默氏杆菌.药敏试验显示该分离株对四环素、环丙沙星、头孢噻肟等高度敏感;对庆大霉素、卡那霉素耐药.动物回... 详细信息

本试验从病死鸭中分离出一株疑似鸭疫里默氏杆菌的病原菌.经形态学观察、生化试验、培养特性鉴定、16SrRNA检测,确定其为鸭疫里默氏杆菌.药敏试验显示该分离株对四环素、环丙沙星、头孢噻肟等高度敏感;对庆大霉素、卡那霉素耐药.动物回归试验表明鸭疫里默氏杆菌具有较强致病性.

关键词：鸭疫里默氏杆菌药敏试验动物回归试验