Ⅰ群禽腺病毒多种血清型的致病性和Hexon、Fiber基因序列分析及其抗体交叉中和试验

作     者：傅禹铭 

作者单位：佛山科学技术学院 

学位级别：硕士

导师姓名：黄淑坚

授予年度：2021年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：禽腺病毒 序列分析 荧光定量 交叉中和 致病性 

摘      要：禽腺病毒(Fowl Adenovirus,Fadv)自1987年首次爆发以来迅速传播全球,对家禽养殖业造成重大损失。禽腺病毒可根据病毒基因结构与序列长短分为三个群:Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群。目前危害我国家禽养殖业禽腺病毒以Ⅰ群为主。I群禽腺病毒又可根据血清型分为12个,经过长期的流行病学调查研究发现对以陆生禽类养殖为主的养殖企业或者散养户Fadv-4、Fadv-8a、Fadv-8b、Fadv-11这四种血清型最为普遍。本研究旨在研究禽腺病毒分离株致病性及血清交叉保护作用为后续疫苗研制提供数据支持。本研究涉及从2014～2020年间实验室保存Ⅰ群Fadv分离株进行分子生物学鉴定,确定各个分离株血清型。结果为:5株4型分离株(GDDL-4、GDHQY-4、GDLHX-4、GDZMY-4、GDZYQ-4);2株8型分离株(GDB3-8a、GDT08-8b);2株11型分离株(GDWYT-11、GDZWJ-11)共9株。随后对各个血清型分离株Hexon基因与Fiber基因遗传演化分析,结果为GDDL-4、GDHQY-4、GDLHX-4、GDZMY-4、GDZYQ-4分离株与Fadv-4参考序列(Gen Bank:MG856954.1)同源性90%～100%;GDB3-8a、GDT08-8b分离株与Fadv-8参考序列(Gen Bank:KT862810.1)同源性97.1%～97.5%;GDWYT-11、GDZWJ-11分离株与Fadv-11参考序列(Gen Bank:KT862816.1)同源性97.4%～97.9%,各个分离株均包含多个氨基酸位点突变;根据遗传演化分析可知,本研究中涉及血清4型分离株Hexon、Fiber基因源自国内演变而来。针对目标分离株(GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11)设计不同的特异性荧光定量引物,成功建立针对三种血清型的I群禽腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法。结果为Fadv-4标准曲线:y=-3.5237x+44.979,相关系数R=0.9987,扩增效率E=91.89%;Fadv-8标准曲线:y=-3.387x+44.038,相关系数R=0.9993,扩增效率E=97.62%;Fadv-11标准曲线:y=-3.673x+48.257,相关系数R=0.9966,扩增效率E=86%;构建经过测试均表现出良好特异性、敏感度和稳定性。下一步,为探究分离株(GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11)的致病性在鸡胚、鸭胚和LMH细胞上的差异进行攻毒实验。结果显示分离株对鸡胚、鸭胚致病性较弱,接种后未见死胚,尿囊液澄清,胚体无异常变化;而研究发现其对LMH细胞致病性较强,可导致细胞在第5代时出现严重CPE;目标分离株感染细胞后48～60 h可达到峰值滴度,其中以GDWYT-11在LMH细胞上增殖效率更高。TCID显示目标分离株均具有良好的病毒滴度,预示本次研究选择的病毒株更适宜在细胞中生长。为探究目标分离株(GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11)致病性对10日龄SPF雏鸡的影响,本次实验设立GDDL-4组、GDB3-8a组、GDT08-8b组、GDWYT-11组、阴性对照组,选择腿部肌肉注射接种10TCID/0.2 m L病毒液。观察SPF雏鸡死亡情况、剖检病变。结果显示四株目标毒株均可导致严重心包积液-包涵体肝炎综合征,GDDL-4组症状最为严重,病死率最高可达85%,总体死亡率在0～85%之间。排毒分析结果为目标分离株均可导致病鸡反复排毒,GDDL-4组、GDB3-8a组出现大滴度排毒(≥10000 copies/μL),GDT08-8b组、GDWYT-11组仅能检测到低滴度(≤1000 copies/μL)排毒。病毒载量分析结果显示,目标分离株均有广泛亲嗜性,在肝脏与肠道病毒载量最高。随后的交叉中和试验结果显示Fadv-4血清能够中和Fadv-11病毒,Fadv-8a之间Fadv-8b不能产生交叉中和作用,Fadv-8b血清能和Fadv-11病毒产生中和,预示血清型之间的交叉保护作用复杂,交叉保护作用较差。总结,本研究通过对Fadv分离株进行分子生物学分析、研究其对鸡胚、细胞与动物致病性试验,结合血清交叉中和试验的结果,得出以下结论(1)Ⅰ禽腺病毒分离株(GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11)更适宜LMH细胞作病毒分离培养;(2)GDDL-4株对10日龄雏鸡致病力最强(死亡率高达85%);(3)血清型之间的交叉保护作用复杂,交叉保护力较弱。