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弓形虫ROP8重组蛋白疫苗对小鼠的保护性研究

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弓形虫ROP8重组蛋白疫苗对小鼠的保护性研究

作者：余一然安徽医科大学

学位级别：硕士

背景弓形虫是一种能引起人兽共患病的细胞内寄生原虫,感染世界约三分之一的人口,在孕妇和免疫力低下人群中可引起严重疾病反应,造成胎儿的先天性眼弓形虫病、畸形、脑积水、死胎等、免疫力低下人群的脑炎、神经性疾病甚至死亡。乙胺嘧... 详细信息

背景弓形虫是一种能引起人兽共患病的细胞内寄生原虫,感染世界约三分之一的人口,在孕妇和免疫力低下人群中可引起严重疾病反应,造成胎儿的先天性眼弓形虫病、畸形、脑积水、死胎等、免疫力低下人群的脑炎、神经性疾病甚至死亡。乙胺嘧啶、磺胺嘧啶只对弓形虫的速殖子阶段有效,开发新的有效的弓形虫疫苗在目前的研究中尤其重要。如DNA疫苗可能会形成基因组整合造成基因污染,灭活疫苗在动物体内会检测到弓形虫DNA的留存并会有逆转的风险,造成新的弓形虫感染。最重要的是,这些开发的灭活疫苗由于伦理因素只能用于动物体内而不能用于人体。近年来,研究人员逐渐把目光聚焦在蛋白疫苗上,蛋白混合佐剂注射入小鼠体内,佐剂可以增强蛋白的抗原性,在保证蛋白质量的情况下,增强蛋白的免疫效果。弓形虫棒状体蛋白(Rhoptry protein,ROP)来自于弓形虫顶端复合体的分泌,在入侵初期分泌至体外,有助于弓形虫建立纳虫泡(Parasitophorous vacuole,PV),从而形成稳定的生态位。其中ROP8蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,但是ROP8在关键位点的退化导致其磷酸化活性的下降甚至消失,但其仍然可以作为ROP18磷酸化的底物,影响宿主的免疫。ROP8在弓形虫的速殖子、缓殖子阶段均有表达可能提示它为一种标志性分子,基于这些特性,使ROP8成为蛋白疫苗的首选位点,本研究将利用生信分析找出ROP8抗原性较强的一段并表达出来,用纯化后的蛋白混合佐剂去免疫BALB/c小鼠,评估其作为疫苗的潜力,为弓形虫疫苗的开发奠定实验基础,同时在此实验基础上对弓形虫进行基因敲除,研究ROP8位点的功能机制。目的探索弓形虫ROP8蛋白作为疫苗的潜力,为弓形虫疫苗的开发奠定理论基础。用CRISPR/Cas9的方法对ROP8基因位点进行敲除,研究ROP8的功能机制。方法(1)使用生信分析软件或在线分析网站,分析rTgROP8蛋白的二级结构,三级结构、亲水性疏水性,跨膜区域、抗原表位。(2)体外诱导表达,混合佐剂注射新西兰图获得兔抗,通过吉姆萨染色,结晶紫染色,双荧光抗体标记的方法测定此多克隆抗体对弓形虫增殖、空斑和入侵的影响。通过双荧光抗体法显示ROP8蛋白在虫体中的位置。(3)蛋白混合佐剂后通过皮下多点注射的方式免疫小鼠,间隔两周免疫一次,共免疫三次。在最后一次免疫完毕两周时收取小鼠血清样本,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的表达水平。(4)测定最后一次免疫后两周的小鼠血清中Ig G、Ig G1、Ig G2a的含量并用OD值表示相对浓度。在最后一次免疫结束后30 d、60 d、90 d检测小鼠血清中的Ig G的含量。(5)在各组中随机选取10只小鼠腹腔注射1×10～4个ME49弓形虫速殖子,记录小鼠的生存时间并绘制生存死亡曲线。在上述三组中随机挑选6只小鼠灌胃20个ME49包囊,在30d后处死小鼠取脑组织计数包囊。(6)构建Donor DNA,突变p SAG1::CAS9-U6::sg ROP8质粒,准备转染所需试剂材料,转染弓形虫并经过药物筛选,鉴定单克隆弓形虫的基因型。结果(1)生物信息分析软件成功预测rTgROP8的二级结构、三级结构、亲水疏水域、抗原表位并给出相应打分。结果显示rTgROP8含有四个潜在的抗原表位的区域。(2)成功构建rTgROP8-p ET28a(+)表达载体,测序验证后,IPTG诱导经过Ni柱纯化得到rTgROP8蛋白,考马斯亮蓝染色显示在20 k Da处有清晰条带;注射新西兰兔后成功获得rTgROP8多克隆抗体。弓形虫增殖、入侵、空斑实验均显示此多克隆抗体在体外对弓形虫的增殖、入侵、形成空斑能力有抑制。双荧光定位显示ROP8蛋白定位于虫体的顶端,并有向外分泌的趋势。(3)ELISA检测显示IFN-γ在免疫组小鼠中升高,但10μg组和20μg组没有统计学差异。IL-2、IL-4、IL-10在各组的表达均没有统计学差异。(4)包被ELISA板显示Ig G在10μg和20μg组中均有升高,且Ig G2a、Ig G1的升高水平相似。测定30 d、60 d、90 d的Ig G水平,都没有明显下降。(5)疫苗保护力测定实验中,急性感染时在接种相同数量速殖子时免疫组比对照组小鼠生存时间更长,延长2天,平均生存时间延长16.6%。慢性感染实验中免疫组小鼠与对照组包囊数明显下降,且有统计学差异。(6)弓形虫成功转染通过乙胺嘧啶筛选后正常生长,PCR1、PCR2条带证明药筛基因进入对应位置,说明此位点已被敲除,但PCR3的条带仍然存在,可能说明该基因为多拷贝基因。结论rTgROP8多克隆抗体能在体外抑制弓形虫的增殖,入侵和形成空斑能力。本研究制备的rTgROP8蛋白疫

关键词：弓形虫假激酶ROP8 蛋白疫苗

Chinese 1型弓形虫眼病小鼠NK细胞亚群的初步分析

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中国病原生物学杂志 2022年第12期17卷 1420-1424页

作者：高南南王崇余一然幸忆恩谢琳玎蔡亦红吴建军安徽医科大学公共卫生学院卫生检验与检疫学系安徽合肥230032 安徽医科大学病原生物学安徽省重点实验室安徽医科大学人畜共患病安徽高校省级重点实验室安徽省疾病预防控制中心安徽省医疗重点专科艾滋病病毒分子与免疫中心实验室

目的建立我国Chinese 1优势基因型获得性弓形虫眼病小鼠模型,分析弓形虫感染对眼组织局部NK细胞及CD49a^(+)NK细胞亚群的影响。方法C57BL/6小鼠经口感染20个弓形虫Wh6包囊,30d后取眼组织,苏木精和伊红(H&E)染色检查病理变化;采用PCR扩... 详细信息

目的建立我国Chinese 1优势基因型获得性弓形虫眼病小鼠模型,分析弓形虫感染对眼组织局部NK细胞及CD49a^(+)NK细胞亚群的影响。方法C57BL/6小鼠经口感染20个弓形虫Wh6包囊,30d后取眼组织,苏木精和伊红(H&E)染色检查病理变化;采用PCR扩增眼组织中的弓形虫ITS-1基因;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫组化方法分析眼组织中的干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子的mRNA及蛋白表达水平;对眼组织转录组测序,进行基因表达差异分析、GO(gene ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析;采用流式细胞术检测眼组织中NK细胞和CD49a^(+)NK细胞亚群水平。结果H&E染色检查感染组小鼠视网膜发生严重的病理改变,PCR扩增眼组织中弓形虫特异性基因ITS-1阳性,qRT-PCR扩增眼组织中细胞因子IFN-γ、TNF-α的mRNA表达上调(P<0.01),免疫组化检查视网膜中IFN-γ、TNF-α表达上调。转录组测序显示,感染组小鼠眼组织中有601个基因表达上调,108个基因表达下调,GO富集分析中差异表达基因在免疫反应、炎症反应等生物过程显著富集,KEGG富集分析显示31个差异表达基因富集在NK细胞介导的细胞毒性通路。流式细胞术检测感染鼠眼组织中NK和CD49a^(+)NK细胞百分比显著增加(P<0.01)。结论成功构建了Chinese 1优势基因型获得性弓形虫眼病小鼠模型,感染鼠眼组织中NK细胞及CD49a^(+)NK细胞亚群百分比增加,提示NK细胞及CD49a^(+)NK细胞亚群在眼组织中积累可能参与弓形虫眼病的发生过程。

关键词：弓形虫眼病 Chinese 1基因型 NK细胞细胞因子

社区更新的健康效应的国际研究综述——概念反思、理论认知与体系架构

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自然资源学报 2025年第1期 74-90页

作者：杨钦然蒋希冀杨林川西南交通大学建筑学院城乡规划系西安建筑科技大学建筑学院城乡规划系

随着中国城市社区更新逐步进入对存量空间的现代化治理阶段，存量空间的问题监测、规划治理、绩效评价及效应追踪的全过程研究将成为未来工作的重点。以概念反思、理论认知和体系架构为逻辑，梳理社区更新健康效应的国际文献，以启示中... 详细信息

随着中国城市社区更新逐步进入对存量空间的现代化治理阶段，存量空间的问题监测、规划治理、绩效评价及效应追踪的全过程研究将成为未来工作的重点。以概念反思、理论认知和体系架构为逻辑，梳理社区更新健康效应的国际文献，以启示中国研究范式转型。研究表明：健康视角下的社区更新是以健康相关的物质和非物质资源提升为目标的综合治理行动，立足人本视角下社区环境的演变规律；社区更新影响居民健康的过程具有多阶段性、多路径性、主体差异性和动态变化性；住房、蓝绿和活动空间、基础设施、餐饮设施、医疗设施，以及社会、心理和经济环境是与健康密切相关的更新要素。基于研究结论，构建了更新绩效评价、健康效应甄别、影响机制解释、规划影响评估及方案优化的四阶段研究体系。

关键词：社区更新健康效应社区环境演变社区更新绩效评价健康影响机制

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儿童药物难治性癫痫的遗传学及临床特征分析

中国全科医学 2025年第6期28卷 756-762页

作者：左然然孙素真河北省儿童医院神经内科河北省小儿癫痫与神经疾病重点实验室河北省石家庄市050000

背景目前儿童药物难治性癫痫(DRE)在儿童癫痫中的占比维持在30%左右,且常合并精神发育迟滞,影响患儿生活质量,因此DRE的诊疗仍然是神经病学的重大挑战。目的分析儿童DRE的遗传学特点及临床特征,为临床进行基因检测提供理论依据。方法回... 详细信息

背景目前儿童药物难治性癫痫(DRE)在儿童癫痫中的占比维持在30%左右,且常合并精神发育迟滞,影响患儿生活质量,因此DRE的诊疗仍然是神经病学的重大挑战。目的分析儿童DRE的遗传学特点及临床特征,为临床进行基因检测提供理论依据。方法回顾性选取2020—2022年于河北省儿童医院住院治疗且完善基因检测的95例DRE患儿为研究对象,根据基因检测结果分为基因突变阳性组(44例)和基因突变阴性组(51例)。收集患儿的一般资料(包括性别、发病年龄、用药情况、发热惊厥史、癫痫家族史等)、临床特征(发作类型、癫痫综合征、发育情况)、辅助检查[基因检测、视频脑电图(VEEG)检查、神经影像学检查],分析DRE的遗传病因及临床特征。结果95例DRE患儿中,男55例(57.9%)、女40例(42.1%),中位发病年龄为1.00(0.50,4.00)岁,用药数量为3(2,4)种;基因突变阳性组患儿发病年龄小于基因突变阴性组(Z=-5.322,P=0.001);两组患儿性别、发热惊厥史、癫痫家族史、用药数量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。38例(40.0%)的患儿确诊为癫痫综合征,其中76.3%(29/38)在新生儿或婴儿期发病;基因突变阳性组患儿癫痫综合征占比高于基因突变阴性组(χ^(2)=12.065,P=0.001)。临床发作类型多样,最常见的为2种及以上发作类型,占52.6%(50/95),其次为单一局灶性发作,占33.7%(32/95);两组DRE患儿发作类型比较,差异无统计学意义(χ^(2)=2.920,P=0.404)。57例患儿完善了发育筛查,其中43例(75.4%)在发病后出现不同程度的发育迟缓,33例(76.7%)表现为全面性发育迟缓;基因突变阳性组患儿发育迟缓占比高于基因突变阴性组(χ^(2)=5.728,P=0.017)。44例患儿检出变异基因,阳性检出率为46.3%,其中以离子通道类变异为主,SCN1A为最常见的单基因突变。90例(94.7%)患儿VEEG检查异常,以局灶性癫痫放电为主;基因突变阳性组患儿高峰失律占比高于基因突变阴性组(χ^(2)=7.425,P=0.006)。25例(26.3%)患儿存在结构性病因,其中基因突变阳性组12例,基因突变阴性组13例;两组DRE患儿结构性病因比较,差异无统计学意义(χ^(2)=0.039,P=0.844)。结论遗传因素为儿童DRE的重要病因,提示发病年龄小、发育迟缓与遗传性病因有关,应积极早期完善基因检测,有助于早期诊断DRE并精准治疗。

关键词：药物难治性癫痫儿童遗传学基因检测癫痫综合征临床特征全面性发育迟缓

发芽糙米特征营养、食味品质提升及功能性评价研究进展

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食品科学 2025年第1期46卷 284-292页

作者：任传英洪滨张珊袁迪冯俊然山珊张竞一管立军李波黄文功卢淑雯黑龙江省农业科学院食品加工研究所黑龙江省食品加工重点实验室黑龙江省全谷物营养食品工程技术研究中心黑龙江哈尔滨150086 黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所黑龙江哈尔滨150086

发芽糙米作为一种全谷物,保留了完整的皮层和胚,集中了大部分营养素和功能性活性物质,但由于皮层纤维结构致密,蒸饭过程中阻碍了吸水速率、吸水量和淀粉糊化,与大米相比,其蒸煮性和食用品质较差,且难以同煮同熟,因此一直以来未被广大消... 详细信息

发芽糙米作为一种全谷物,保留了完整的皮层和胚,集中了大部分营养素和功能性活性物质,但由于皮层纤维结构致密,蒸饭过程中阻碍了吸水速率、吸水量和淀粉糊化,与大米相比,其蒸煮性和食用品质较差,且难以同煮同熟,因此一直以来未被广大消费者接受。本文综述糙米发芽的生理代谢反应及发芽过程中营养成分、活性成分和食味品质的变化,总结发芽糙米胁迫富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)技术和发芽糙米的功能特性研究现状。糙米发芽过程中,多种生物活性物质在酶促反应下富集,尤其是特征成分GABA含量显著提升。多种逆境胁迫均可通过改变Ca^(2+)、H^(+)或底物水平促进GABA富集,一些预处理技术可进一步提升发芽糙米的食味品质。GABA与其他营养成分和活性成分发挥协同作用,赋予发芽糙米抗高血脂、抗高血糖、保护心脏、改善睡眠、抗炎和抗氧化等一系列功效与作用。

关键词：发芽糙米特征营养食味品质功能性

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基于疏肝祛湿化瘀法的肝积方治疗老年肝癌相关肝纤维化的效果

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中国老年学杂志 2025年第1期 33-37页

作者：余一帆于承洋罗慧燕王雄文蔡玉荣广州中医药大学第一临床医学院广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心

目的探究基于疏肝祛湿化瘀法的肝积方治疗老年肝癌相关肝纤维化的效果。方法回顾性研究70例老年原发性肝癌患者资料，根据治疗方法分为观察组与对照组各35例，观察组使用西医标准治疗联合使用疏肝祛湿化瘀法指导组方的肝积方治疗，对... 详细信息

目的探究基于疏肝祛湿化瘀法的肝积方治疗老年肝癌相关肝纤维化的效果。方法回顾性研究70例老年原发性肝癌患者资料，根据治疗方法分为观察组与对照组各35例，观察组使用西医标准治疗联合使用疏肝祛湿化瘀法指导组方的肝积方治疗，对照组使用西医标准治疗联合非肝积方的非标准化中医治疗。观察两组治疗前后中医证候积分、Child-pugh肝功能分级、肝纤维化预测指标[门冬氨酸转移酶纤维化指数(APRI)、谷氨酰转肽酶与血小板比值指数(GPRI)、基于4因子的肝纤维化指标(FIB)-4、红细胞体积分布宽度-血小板比值(RPR)、国际标准化比值/血小板比值(INPR)]。观察两者肝功能改善情况及临床疗效。结果治疗后观察组中医证候积分、肝功能恶化程度显著低于对照组(P<0.05),且观察组GPRI、RPR、INPR较前明显改善(P<0.05)。结论疏肝祛湿化瘀法指导组方的肝积方能缓解脘胁胀痛、食少的症状，抑制老年原发性肝癌患者的肝功能恶化，且能明显改善肝纤维化。

关键词：疏肝祛湿化瘀法原发性肝癌肝纤维化

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“如果A才B”的构式整合与功能分析

世界汉语教学 2025年第1期 64-76页

作者：孙瑾陈一哈尔滨师范大学文学院

现代汉语假设条件表达中，存在一种超常规的“如果A才B”组配，具有独特的语用功能。本文对“如果A才B”的生成动因、整合机制、语篇功能、人际功能进行全面考察分析。作为一种体现“量度必备性”的必要条件假设构式，“如果A才B”的构... 详细信息

现代汉语假设条件表达中，存在一种超常规的“如果A才B”组配，具有独特的语用功能。本文对“如果A才B”的生成动因、整合机制、语篇功能、人际功能进行全面考察分析。作为一种体现“量度必备性”的必要条件假设构式，“如果A才B”的构式义可概括为：(受话方)现有认知条件下就预期某种结果出现尚不具有高度可确定性，必须具备特定量级程度标准，预期结果才能达成。该构式具有交互性特征，表达非共知性认识，是比较典型的主观化构式。交际中“如果……才”常通过量级成分否定充分条件关系，实施逆向回应行为，具有调整预期和命题修正功能。语篇中“如果A才B”蕴含潜对话关系的存在，引导释话人对“如果”条件得出必备性认知。文章对必要条件表达式的再分类、“如果”的多用性和认知调控功能以及相关构式网络的联结方式做出一些新的分析。

关键词：构式整合必要条件假设主观性人际功能语篇对话性

声名远扬：清代岭南文学传播的意识、路径与效应

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中国编辑 2025年第1期 96-104页

作者：黄一玫北京外国语大学国际中国文化研究院

清代是岭南文学从默默无闻走向声名大振的关键时期，岭南文人有意识地传播地域文学，经营名声，通过交游网络、诗文集和报刊等多种方式使作品与文人在更广阔的范围内被阅读与讨论。考察清代岭南文学传播的意识、路径与效应，还原地域文... 详细信息

清代是岭南文学从默默无闻走向声名大振的关键时期，岭南文人有意识地传播地域文学，经营名声，通过交游网络、诗文集和报刊等多种方式使作品与文人在更广阔的范围内被阅读与讨论。考察清代岭南文学传播的意识、路径与效应，还原地域文学接受的历史现场，从而可对清代文学的传播生态与文学风貌有更全面且深入的认识。

关键词：清代岭南文学传播意识传播路径传播效应文集编纂新式报刊

加温膀胱冲洗对经尿道膀胱电切术后患者膀胱功能及生活质量的影响

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临床医药实践 2025年第1期34卷 59-61页

作者：付凯然天津市第四中心医院天津300000

目的:探讨加温膀胱冲洗对经尿道膀胱电切术后患者膀胱功能及生活质量的影响。方法:选取2022年3月—2024年3月收治的88例接受经尿道膀胱电切术治疗的膀胱癌患者,按随机数字表法分为对照组和观察组,每组44例。对照组给予常规室温膀胱冲洗... 详细信息

目的:探讨加温膀胱冲洗对经尿道膀胱电切术后患者膀胱功能及生活质量的影响。方法:选取2022年3月—2024年3月收治的88例接受经尿道膀胱电切术治疗的膀胱癌患者,按随机数字表法分为对照组和观察组,每组44例。对照组给予常规室温膀胱冲洗,观察组给予加温膀胱冲洗,比较两组术后膀胱痉挛情况、膀胱冲洗时间、冲洗液量、膀胱出血与血凝块堵管发生率、生活质量。结果:干预后,观察组术后膀胱痉挛发生次数少于对照组,每次持续时间短于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);观察组术后膀胱冲洗时间短于对照组,膀胱冲洗液量小于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);观察组术后膀胱出血、血凝块堵管发生率均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组术后3个月的癌症治疗功能评估之膀胱癌(FACT-BL)各个维度评分均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:加温膀胱冲洗能够改善经尿道膀胱电切术后患者膀胱痉挛情况,缩短膀胱冲洗时间,减少膀胱冲洗液量,降低膀胱出血、血凝块堵管发生风险,提高患者术后生活质量。

关键词：加温膀胱冲洗经尿道膀胱电切术膀胱痉挛膀胱冲洗时间生活质量