弓形虫ROP8重组蛋白疫苗对小鼠的保护性研究
作者单位：安徽医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：姚余有;蔡亦红
授予年度：2023年
学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学]
摘 要：背景弓形虫是一种能引起人兽共患病的细胞内寄生原虫,感染世界约三分之一的人口,在孕妇和免疫力低下人群中可引起严重疾病反应,造成胎儿的先天性眼弓形虫病、畸形、脑积水、死胎等、免疫力低下人群的脑炎、神经性疾病甚至死亡。乙胺嘧啶、磺胺嘧啶只对弓形虫的速殖子阶段有效,开发新的有效的弓形虫疫苗在目前的研究中尤其重要。如DNA疫苗可能会形成基因组整合造成基因污染,灭活疫苗在动物体内会检测到弓形虫DNA的留存并会有逆转的风险,造成新的弓形虫感染。最重要的是,这些开发的灭活疫苗由于伦理因素只能用于动物体内而不能用于人体。近年来,研究人员逐渐把目光聚焦在蛋白疫苗上,蛋白混合佐剂注射入小鼠体内,佐剂可以增强蛋白的抗原性,在保证蛋白质量的情况下,增强蛋白的免疫效果。弓形虫棒状体蛋白(Rhoptry protein,ROP)来自于弓形虫顶端复合体的分泌,在入侵初期分泌至体外,有助于弓形虫建立纳虫泡(Parasitophorous vacuole,PV),从而形成稳定的生态位。其中ROP8蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,但是ROP8在关键位点的退化导致其磷酸化活性的下降甚至消失,但其仍然可以作为ROP18磷酸化的底物,影响宿主的免疫。ROP8在弓形虫的速殖子、缓殖子阶段均有表达可能提示它为一种标志性分子,基于这些特性,使ROP8成为蛋白疫苗的首选位点,本研究将利用生信分析找出ROP8抗原性较强的一段并表达出来,用纯化后的蛋白混合佐剂去免疫BALB/c小鼠,评估其作为疫苗的潜力,为弓形虫疫苗的开发奠定实验基础,同时在此实验基础上对弓形虫进行基因敲除,研究ROP8位点的功能机制。目的探索弓形虫ROP8蛋白作为疫苗的潜力,为弓形虫疫苗的开发奠定理论基础。用CRISPR/Cas9的方法对ROP8基因位点进行敲除,研究ROP8的功能机制。方法(1)使用生信分析软件或在线分析网站,分析rTgROP8蛋白的二级结构,三级结构、亲水性疏水性,跨膜区域、抗原表位。(2)体外诱导表达,混合佐剂注射新西兰图获得兔抗,通过吉姆萨染色,结晶紫染色,双荧光抗体标记的方法测定此多克隆抗体对弓形虫增殖、空斑和入侵的影响。通过双荧光抗体法显示ROP8蛋白在虫体中的位置。(3)蛋白混合佐剂后通过皮下多点注射的方式免疫小鼠,间隔两周免疫一次,共免疫三次。在最后一次免疫完毕两周时收取小鼠血清样本,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的表达水平。(4)测定最后一次免疫后两周的小鼠血清中Ig G、Ig G1、Ig G2a的含量并用OD值表示相对浓度。在最后一次免疫结束后30 d、60 d、90 d检测小鼠血清中的Ig G的含量。(5)在各组中随机选取10只小鼠腹腔注射1×10～4个ME49弓形虫速殖子,记录小鼠的生存时间并绘制生存死亡曲线。在上述三组中随机挑选6只小鼠灌胃20个ME49包囊,在30d后处死小鼠取脑组织计数包囊。(6)构建Donor DNA,突变p SAG1::CAS9-U6::sg ROP8质粒,准备转染所需试剂材料,转染弓形虫并经过药物筛选,鉴定单克隆弓形虫的基因型。结果(1)生物信息分析软件成功预测rTgROP8的二级结构、三级结构、亲水疏水域、抗原表位并给出相应打分。结果显示rTgROP8含有四个潜在的抗原表位的区域。(2)成功构建rTgROP8-p ET28a(+)表达载体,测序验证后,IPTG诱导经过Ni柱纯化得到rTgROP8蛋白,考马斯亮蓝染色显示在20 k Da处有清晰条带;注射新西兰兔后成功获得rTgROP8多克隆抗体。弓形虫增殖、入侵、空斑实验均显示此多克隆抗体在体外对弓形虫的增殖、入侵、形成空斑能力有抑制。双荧光定位显示ROP8蛋白定位于虫体的顶端,并有向外分泌的趋势。(3)ELISA检测显示IFN-γ在免疫组小鼠中升高,但10μg组和20μg组没有统计学差异。IL-2、IL-4、IL-10在各组的表达均没有统计学差异。(4)包被ELISA板显示Ig G在10μg和20μg组中均有升高,且Ig G2a、Ig G1的升高水平相似。测定30 d、60 d、90 d的Ig G水平,都没有明显下降。(5)疫苗保护力测定实验中,急性感染时在接种相同数量速殖子时免疫组比对照组小鼠生存时间更长,延长2天,平均生存时间延长16.6%。慢性感染实验中免疫组小鼠与对照组包囊数明显下降,且有统计学差异。(6)弓形虫成功转染通过乙胺嘧啶筛选后正常生长,PCR1、PCR2条带证明药筛基因进入对应位置,说明此位点已被敲除,但PCR3的条带仍然存在,可能说明该基因为多拷贝基因。结论rTgROP8多克隆抗体能在体外抑制弓形虫的增殖,入侵和形成空斑能力。本研究制备的rTgROP8蛋白疫
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