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促血小板生成素基因在NIH3T3细胞中表达的定量调节

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中华医学杂志 2000年第10期80卷 773-775页

作者：魏旭东伏爽武莎莎王申五王德炳北京大学人民医院血液病研究所 100044

目的　应用逆转录病毒载体四环素调控系统 ,定量调节促血小板生成素 (TPO)基因在NIH3T3细胞中的表达。方法　pRevTet On质粒转染逆转录病毒包装细胞PT6 7细胞 ,应用包装成Tet On重组逆转录病毒 ,并将此病毒感染NIH3T3细胞 ,建立整合入Te... 详细信息

目的　应用逆转录病毒载体四环素调控系统 ,定量调节促血小板生成素 (TPO)基因在NIH3T3细胞中的表达。方法　pRevTet On质粒转染逆转录病毒包装细胞PT6 7细胞 ,应用包装成Tet On重组逆转录病毒 ,并将此病毒感染NIH3T3细胞 ,建立整合入Tet On逆转录病毒的阳性细胞株(RevTet On3T3) ,并通过强力霉素调控荧光素酶基因的表达证明此细胞株具有调控作用。构建pRevTRETPO重组质粒 ,转染PT6 7细胞 ,包装成含四环素反应元件和血小板生成素基因的重组逆转录病毒。再将此病毒感染上述细胞株 ,建立整和双病毒的细胞株 (RevTet On3T3TPO) ,通过强力霉素调节TPO基因在此细胞株中表达。培养基中加入 5mg·L-1强力霉素 (Dox)或不加Dox ,培养 72h后检测促血小板生成素基因表达情况。结果　RevTet On3T3在培养基中加入Dox时荧光素酶活性高 ,平均为5 .9× 10 4 RLU·S ,当培养基中不加Dox时荧光素酶活性低 ,平均为 2 .6× 10 3RLU·S。RevTet On3T3TPO在培养基中加入Dox时TPO表达量高 ,平均为 12 .8ng/ml。在培养基中不加入Dox时TPO表达量低 ,平均为 0 .5 6ng/ml,加Dox组为不加Dox组的 2 2 8倍。结论　建立逆转录病毒整合的NIH3T3细胞株 ,可利用四环素及其衍生物定时、定量调节多种外源基因的表达 ,增加基因治疗的精确性和?

关键词：血小板生成素荧光素酶基因表达 NIH3T3细胞

血小板生成素基因在NIH/3T3细胞中的表达与调控

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中国生物化学与分子生物学报 2000年第3期16卷 312-317页

作者：伏爽程康陆爱丽魏旭东王申五王德炳 *** 北京医科大学人民医院血液病研究所北京100044 北京医科大学生物化学与分子生物学系北京100083

应用 Tet- On基因表达系统 ,调控血小板生成素 (TPO)基因在 NIH/3T3细胞中的表达时间与水平 .籍脂质体介导的基因转移方法 ,p Tet- On质粒转染 NIH/3T3细胞株 ,得到稳定细胞株NIH/3T3- Tet- On.p TRE/TPO与 p TK- Hyg质粒共转染 NIH/3T3... 详细信息

应用 Tet- On基因表达系统 ,调控血小板生成素 (TPO)基因在 NIH/3T3细胞中的表达时间与水平 .籍脂质体介导的基因转移方法 ,p Tet- On质粒转染 NIH/3T3细胞株 ,得到稳定细胞株NIH/3T3- Tet- On.p TRE/TPO与 p TK- Hyg质粒共转染 NIH/3T3- Tet- On细胞株 ,得到双稳定细胞株 NIH/3T3- Tet- On- TPO.在培养基中加入或不加强力霉素 ,RT- PCR、Western印迹及 ELISA法检测培养上清 TPO表达 .结果表明 ,当培养基中不加强力霉素时 ,TPO无明显表达 (0 .1 μg/L) ;当培养基中加入 2 mg/L强力霉素时 ,TPO表达明显增高 (1 0 .8μg/L) .TPO表达水平与强力霉素浓度有关 ,随强力霉素浓度增高 ,TPO表达增加 .TPO表达水平还与强力霉素作用时间有关 ,加入强力霉素 6 h后 ,TPO表达明显增加 (1 .2μg/L) ,随培养时间延长 ,TPO表达增加 ,2 4 h达到峰值(1 0 .8μg/L) ,而且这种诱导作用是可逆的 .为进一步进行 TPO基因表达调控的体内研究奠定基础 ,有望为

关键词：基因表达调控 NIH/3T3 TPO 强力霉素基因治疗

Tet-On基因表达系统定量调节荧光素酶基因在CHO细胞中的表达

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北京医科大学学报 1998年第6期30卷 512-514,554页

作者：伏爽程康王申五马大龙王德炳北京医科大学人民医院血液病研究所北京医科大学分子免疫学研究中心

目的：应用ＴｅｔＯｎ基因表达系统建立ＣＨＯＴｅｔＯｎ细胞株，通过强力霉素（Ｄｏｘ）调节荧光素酶基因的表达。方法：ｐＴｅｔＯｎ质粒转染ＣＨＯ细胞株，经Ｇ４１８筛选，得到稳定表达株ＣＨＯＴｅｔＯｎ。ｐＴＲＥ... 详细信息

目的：应用ＴｅｔＯｎ基因表达系统建立ＣＨＯＴｅｔＯｎ细胞株，通过强力霉素（Ｄｏｘ）调节荧光素酶基因的表达。方法：ｐＴｅｔＯｎ质粒转染ＣＨＯ细胞株，经Ｇ４１８筛选，得到稳定表达株ＣＨＯＴｅｔＯｎ。ｐＴＲＥＬｕｃ质粒瞬时转染ＣＨＯＴｅｔＯｎ克隆１至３０，培养基中加入２ｍｇ·Ｌ－１Ｄｏｘ或不加Ｄｏｘ，培养７２ｈ后检测荧光素酶活性。结果：克隆１８、２８、２９当培养基中加入Ｄｏｘ（即“Ｏｎ”状态）时荧光素酶活性高，当培养基中不加Ｄｏｘ（即“Ｏｆ”状态）时荧光素酶活性低，故选择克隆１８、２８、２９作为高表达、低背景的ＣＨＯＴｅｔＯｎ细胞株。结论：ＣＨＯＴｅｔＯｎ细胞株的建立，可利用四环素及其衍生物调节多种外源基因的表达，有效调控基因表达的时间和水平，定量诱导毒性蛋白的表达，增加治疗的疗效和安全性，有望为基因治疗提供一条可控的安全途径。

关键词： Tet-On基因基因表达调控荧光素酶基因 CHO细胞

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人血小板生成素重组载体的构建与体外表达

中国生物化学与分子生物学报 1999年第3期15卷 378-382页

作者：韩安平陆爱丽伏爽王申五侯纬敏王德炳北京医科大学血液病学研究所北京医科大学生物化学与分子生物学系

应用基因克隆技术，以人ＴＰＯｃＤＮＡ为目的基因，构建真核细胞表达重组体ＶＲＴＰＯ，藉脂质体将其转染于ＮＩＨ３Ｔ３细胞，应用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等技术对其转染及表达情况进行鉴定．结果表明：ＶＲＴＰＯ... 详细信息

应用基因克隆技术，以人ＴＰＯｃＤＮＡ为目的基因，构建真核细胞表达重组体ＶＲＴＰＯ，藉脂质体将其转染于ＮＩＨ３Ｔ３细胞，应用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等技术对其转染及表达情况进行鉴定．结果表明：ＶＲＴＰＯ构建成功，在ＮＩＨ３Ｔ３细胞可表达人ＴＰＯ。

关键词：血小板生成素基因重组基因转移基因表达

重组人血小板生成素基因在COS-7细胞及在小鼠体内的转移与表达

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中国实验血液学杂志 2001年第1期9卷 14-17页

作者：臧维苹魏旭东伏爽王申五汤健王德炳北京大学人民医院血液病研究所北京100044 北京大学医学部心血管病基础研究所北京100083

为了观察重组血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)基因在COS 7细胞及在小鼠体内的表达 ,应用DNA重组技术构建了含TPO基因的真核表达质粒 pcd2 TPO ,用脂质体法将其转染COS 7细胞 ,用裸质粒DNA直接注射加电脉冲的方法将 pcd2 TPO质粒... 详细信息

为了观察重组血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)基因在COS 7细胞及在小鼠体内的表达 ,应用DNA重组技术构建了含TPO基因的真核表达质粒 pcd2 TPO ,用脂质体法将其转染COS 7细胞 ,用裸质粒DNA直接注射加电脉冲的方法将 pcd2 TPO质粒转移到小鼠骨骼肌中。用RT PCR及ELISA法检测到TPO基因在COS 7细胞的瞬时表达 ,MTT法显示其有刺激TPO依赖细胞系增殖的活性。RT PCR及免疫组织化学染色可检测到TPO基因在转基因小鼠骨骼肌的表达 ,ELISA法定量检测转基因组小鼠血清TPO浓度为 (1185± 2 64)ng L ,明显高于正常小鼠的TPO浓度 (2 5 0± 76)ng L。本实验实现了TPO基因在小鼠体内和COS 7细胞的转移。

关键词：血小板生成素 COS-7细胞基因转移基因表达

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以杆状病毒作为基因治疗载体的一种新方法

北京医科大学学报 1999年第4期31卷 312-314页

作者：陆爱丽董东生程康伏爽王德炳侯纬敏北京医科大学生物化学与分子生物学系北京同仁医院

目的：报道一种新的基因治疗方法。方法：将人全长血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ）基因克隆至ｐＢａｃＭａｍ２载体，与ＢａｃＶｅｃｔｏｒ３０００病毒ＤＮＡ共转染昆虫ｓｆ９细胞，经筛选后获得可在哺乳类... 详细信息

目的：报道一种新的基因治疗方法。方法：将人全长血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ）基因克隆至ｐＢａｃＭａｍ２载体，与ＢａｃＶｅｃｔｏｒ３０００病毒ＤＮＡ共转染昆虫ｓｆ９细胞，经筛选后获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒，以此为载体，将人ＴＰＯ基因导入小鼠体内。结果：获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒株，动物实验外周血小板计数升高至正常的２～３倍，ＲＴＰＣＲ结果显示ＴＰＯ在小鼠组织中得到表达。结论：重组ｒｈＴＰＯ昆虫病毒是一种有效的基因治疗载体。

关键词：血小板生成素基因治疗昆虫病毒杆状病毒载体

骨骼肌高表达质粒VR/TPO在CHO细胞中瞬时表达及动物实验

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北京医科大学学报 2000年第3期32卷 269-271页

作者：魏旭东伏爽韩安平程康武莎莎王申五王德炳北京大学人民医院血液病研究所北京100044

构建肌肉高表达质粒VR/TPO ,将其在体外定量表达 ,并初步了解其体内表达活性。方法 :以重组TPOcDNA为目的基因 ,构建人VR/TPO高效表达质粒 ,用脂质体法将其转染CHO细胞 ,RT PCR法检测mRNA表达 ,ELISA法检测TPO的表达量 ,并注入体内了解... 详细信息

构建肌肉高表达质粒VR/TPO ,将其在体外定量表达 ,并初步了解其体内表达活性。方法 :以重组TPOcDNA为目的基因 ,构建人VR/TPO高效表达质粒 ,用脂质体法将其转染CHO细胞 ,RT PCR法检测mRNA表达 ,ELISA法检测TPO的表达量 ,并注入体内了解其对巨核系造血的影响。结果 :VR/TPO可在CHO中高效表达 ,其表达量超过 pcDNA3TPO ,并初步发现有促进血小板增加作用。结论 :VR/TPO为一高效表达TPO质粒 ,在体内外都有一定表达活性。

关键词：血小板生成素基因表达基因转移 CHO细胞

PCR法检测急性淋巴细胞性白血病患者骨髓移植后残留白血病细胞

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北京医科大学学报 1998年第4期30卷 369-369页

作者：伏爽杨耀明程康郭乃榄王德炳北京医科大学人民医院

ＰＣＲ法检测急性淋巴细胞性白血病患者骨髓移植后残留白血病细胞伏爽杨耀明程康郭乃榄王德炳（北京医科大学人民医院血液病研究所，北京１０００４４）近年来，异基因骨髓移植（ａｌｏＢＭＴ）的开展为白血病的治疗翻开了新的一页，... 详细信息

ＰＣＲ法检测急性淋巴细胞性白血病患者骨髓移植后残留白血病细胞伏爽杨耀明程康郭乃榄王德炳（北京医科大学人民医院血液病研究所，北京１０００４４）近年来，异基因骨髓移植（ａｌｏＢＭＴ）的开展为白血病的治疗翻开了新的一页，成为真正彻底治愈白血病的重要手段。...

关键词：白血病 ALL 骨髓移植残留白血病细胞 PCR

RevTet-On系统调控血小板生成素基因表达的研究

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中国实验血液学杂志 2000年第4期8卷 241-244页

作者：魏旭东伏爽藏维平武莎莎王申五王德炳北京大学人民医院血液病研究所北京100044

本研究应用RevTet On基因表达系统 ,通过四环素衍生物强力霉素 (doxcycline ,Dox)调控血小板生成素 (TPO)基因在NIH3T3细胞中的表达。首先应用基因重组技术构建含TPO基因的重组质粒 pRevTRE/TPO ,然后将RevTet On基因调控系统的pRevTet... 详细信息

本研究应用RevTet On基因表达系统 ,通过四环素衍生物强力霉素 (doxcycline ,Dox)调控血小板生成素 (TPO)基因在NIH3T3细胞中的表达。首先应用基因重组技术构建含TPO基因的重组质粒 pRevTRE/TPO ,然后将RevTet On基因调控系统的pRevTet On和 pRevTRE/TPO分别转染PT67细胞 ,从而包装RevTet On和RevTRE/TPO重组逆转录病毒 ,同时将此两种病毒感染NIH3T3细胞 ,建立整合入RevTet On和RevTRE/TPO逆转录病毒的阳性细胞株 (RevTet On3T3/TPO)。通过Dox调节TPO基因在此细胞株中表达 ,培养基中加入 2mg/LDox或不加Dox ,然后用RT PCR ,Western印迹和ELISA方法检测TPO基因表达情况。结果发现 ,RevTet On3T3/TPO当培养基中不加Dox时用RT PCR和Western印迹检测未见TPO表达 ,用ELISA检测表达TPO量低 ;在培养基中加入Dox时 ,RT PCR和Western印迹检测可见TPO表达 ,且TPO表达量高 ,为不加Dox时的 91倍。本实验表明 ,通过建立逆转录病毒整合的NIH3T3细胞株 ,利用四环素及其衍生物Dox调节TPO基因的表达。

关键词： RevTet-On系统血小板生成素基因表达 NIH3T3细胞