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重组谷氨酸棒杆菌全细胞催化一步法合成高果糖浆

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食品与发酵工业 2022年第2期48卷 8-14页

作者： HABIMANA 乔郅钠徐美娟杨套伟张显邵明龙饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

高果糖浆是一种可替代蔗糖的甜味剂,在食品和饮料行业应用广泛。该研究实现了经密码子优化的密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis) CICIM B0118(A)来源的葡萄糖异构酶在食品安全菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ... 详细信息

高果糖浆是一种可替代蔗糖的甜味剂,在食品和饮料行业应用广泛。该研究实现了经密码子优化的密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis) CICIM B0118(A)来源的葡萄糖异构酶在食品安全菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) 13032中的异源表达,构建了重组谷氨酸棒杆菌*** 13032/pXMJ19-xylA。以其细胞菌体作为全细胞催化剂,对D-葡萄糖异构化生成D-果糖的全细胞转化体系进行优化,结果表明,菌体质量浓度40 g/L、底物D-葡萄糖质量浓度180 g/L、Mg^(2+)浓度10 mmol/L、Co^(2+)浓度1 mmol/L,70℃、220 r/min下连续转化18 h,D-果糖质量浓度达到103.32 g/L,转化率为57.4%,实现了高果糖浆的一步法安全生物合成。该研究为高果糖浆的工业化生产提供了实验和理论基础,具有重要的参考价值。

关键词：葡萄糖异构酶异构化全细胞催化谷氨酸棒杆菌高果糖浆

理性代谢工程改造促进谷氨酸棒杆菌高效合成L-谷氨酰胺

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食品与生物技术学报 2022年第8期41卷 65-74页

作者：乔郅钠吕青兰李翔飞王晴徐美娟饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

L-谷氨酰胺(L-glutamine,L-Gln)是人体液中含量最丰富的一种半必需氨基酸,具有多种营养和药理功能,被广泛应用于医药、食品添加剂、营养保健品、饲料等领域。目前,微生物发酵法是生产L-Gln的主要方法,发酵产酸效率低、副产物多、菌种性... 详细信息

L-谷氨酰胺(L-glutamine,L-Gln)是人体液中含量最丰富的一种半必需氨基酸,具有多种营养和药理功能,被广泛应用于医药、食品添加剂、营养保健品、饲料等领域。目前,微生物发酵法是生产L-Gln的主要方法,发酵产酸效率低、副产物多、菌种性能欠缺等问题严重限制了其工业化应用。为解决这一问题,作者以实验室前期构建的L-Gln生产菌株CGQ03为出发菌株,通过强化谷氨酸脱氢酶表达及辅因子NADPH供应促进前体L-谷氨酸合成、增强辅因子ATP胞内含量、过表达溶氧相关蛋白VHb提高细胞携氧能力、增强关键酶谷氨酰胺合成酶催化活性及发酵工艺优化等策略提高了L-Gln产量。最终的基因工程菌CGQ08/pDXW10-glnASc-gdhCg在5 L发酵罐上补料分批发酵66 h,L-Gln的产量最高达(94.5±1.8)g/L,糖酸转化率为34.8%,生产强度为1.43 g/(L·h)。本研究为L-Gln及其相关化合物的工业化生产提供了借鉴。

关键词： L-谷氨酰胺谷氨酸棒杆菌谷氨酰胺合酶 NADPH供应 ATP供应发酵工艺优化

理性代谢工程改造促进谷氨酸棒杆菌高效合成L-谷氨酸

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生物工程学报 2023年第8期39卷 3273-3289页

作者：刘佳峰乔郅钠赵有玺徐美娟张显杨套伟饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122 北京联合大学生物化学工程学院北京100023

L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品,广泛应用于食品医药及化工等行业。以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为出发菌株,首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT),降低了发... 详细信息

L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品,广泛应用于食品医药及化工等行业。以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为出发菌株,首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT),降低了发酵副产物丙氨酸含量。其次,α-酮戊二酸节点碳流量对谷氨酸合成起重要作用,因此,采用核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)序列优化降低了α-酮戊二酸脱氢酶的活性,强化了谷氨酸合成代谢流。同时通过筛选不同来源的谷氨酸脱氢酶,加强了α-酮戊二酸内源转化为谷氨酸的能力。接着,对谷氨酸转运蛋白进行理性设计,提高了谷氨酸的外排能力。最后,对基于以上策略构建的整合菌株进行了5L发酵罐发酵优化,通过梯度升温结合分批补料策略,谷氨酸产量为(136.33±4.68)g/L,较原始菌的产量(96.53±2.32)g/L提高了41.2%;糖酸转化率为55.8%,较原始菌的44.2%提高了11.6%;且降低了副产物丙氨酸的含量。以上策略一定程度上提高了谷氨酸的产量与糖酸转化率,可为谷氨酸生产菌株的代谢改造提供参考。

关键词：谷氨酸棒杆菌谷氨酸转录分析核糖体结合位点(RBS)序列优化谷氨酸转运蛋白

以L-亮氨酸为底物一步法生物合成α-酮异己酸

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食品与发酵工业 2021年第13期47卷 1-8页

作者： AL-ADEEB Abdulqader 乔郅钠徐美娟杨套伟张显邵明龙饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

α-酮异己酸是重要的有机合成和药物合成中间体,在食品、医药和化工行业中应用广泛。目前,α-酮异己酸的合成以化学法为主,需要高成本的催化剂或特殊的起始结构,导致α-酮异己酸生产成本较高。首次在食品安全性菌株枯草芽孢杆菌(Bacillu... 详细信息

α-酮异己酸是重要的有机合成和药物合成中间体,在食品、医药和化工行业中应用广泛。目前,α-酮异己酸的合成以化学法为主,需要高成本的催化剂或特殊的起始结构,导致α-酮异己酸生产成本较高。首次在食品安全性菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168中异源表达了普通变形杆菌(Proteus vulgaris)来源的L-氨基酸脱氨酶,以重组枯草芽孢杆菌作为全细胞催化剂、L-亮氨酸为底物实现了α-酮异己酸的一步法生物合成。其次,针对全细胞催化条件进行优化,最优条件(全细胞催化剂20 g/L、L-亮氨酸浓度100 mmol/L、反应温度45℃、pH 10.0、MgCl 2浓度5 mmol/L)下,转化24 h,可获得3.66 g/L的α-酮异己酸,且重复转化3次后,固定化细胞比游离细胞的再利用率提高了37.3%。该研究成功实现了以食品安全菌株*** 168为宿主一步法生物合成α-酮异己酸,为α-酮异己酸以及其他重要α-酮酸的工业化安全合成提供了新策略。

关键词：普通变形杆菌 L-氨基酸脱氨酶枯草芽孢杆菌 L-亮氨酸全细胞催化固定化细胞 α-酮异己酸

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赖氨酸脱羧酶分子改造及其催化合成戊二胺

食品与发酵工业 2022年第1期48卷 8-14页

作者： OSIRE Tolbert 杨套伟乔郅钠孙杨徐美娟张显邵明龙饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

1,5-戊二胺(戊二胺)具有良好的生物活性,广泛应用在农业、医药以及工业等领域。赖氨酸脱羧酶可以催化L-赖氨酸生产戊二胺,为了提高赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺的效率,首先在大肠杆菌中克隆表达了粘质沙雷氏菌来源的赖氨酸脱羧酶(SmcadA... 详细信息

1,5-戊二胺(戊二胺)具有良好的生物活性,广泛应用在农业、医药以及工业等领域。赖氨酸脱羧酶可以催化L-赖氨酸生产戊二胺,为了提高赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺的效率,首先在大肠杆菌中克隆表达了粘质沙雷氏菌来源的赖氨酸脱羧酶(SmcadA)。生化特征表明,SmcadA最适催化pH为6.0,最适催化温度约为40℃。随后对SmcadA的第348位氨基酸进行了突变研究,筛选获得了催化效率显著提高的突变体Gly348Ala,主要原因是该突变导致蛋白中氨基酸残基和底物之间相互作用的氢键数增加,从而影响其催化效率。最后,对重组菌株细胞进行了戊二胺合成研究,催化反应25 h,含有突变体Gly348Ala的重组菌细胞可以催化合成218.2 g/L戊二胺,野生型SmcadA重组菌仅能催化合成159.2 g/L戊二胺。该研究结果为工业化酶催化合成戊二胺提供了借鉴。

关键词：赖氨酸脱羧酶分子改造氢键酶催化戊二胺

重组枯草芽孢杆菌全细胞高效催化合成D-甘露糖

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生物工程学报 2024年第9期40卷 3158-3170页

作者：刘祖怡乔郅钠杜宇轩石选平尤甲甲饶志明王立江南大学食品学院江苏无锡214122 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

D-甘露糖是一种在食品、医疗、化妆品等领域具有很大经济价值和应用价值的天然己糖。但是目前大部分生物合成法都是以大肠杆菌作为宿主,生产过程中存在安全性问题,对后续应用产生了诸多限制。本研究通过比较多个来源的甘露糖异构酶的酶... 详细信息

D-甘露糖是一种在食品、医疗、化妆品等领域具有很大经济价值和应用价值的天然己糖。但是目前大部分生物合成法都是以大肠杆菌作为宿主,生产过程中存在安全性问题,对后续应用产生了诸多限制。本研究通过比较多个来源的甘露糖异构酶的酶学性质,筛选出最优来源甘露糖异构酶。以食品安全级菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为底盘细胞,将最优来源的甘露糖异构酶进行异源表达,获得了重组菌株*** 168/pMA5-EcMIaseA,用于以D-果糖为底物全细胞催化高效合成D-甘露糖。通过优化转化温度、pH、底物浓度等条件,提高其转化合成D-甘露糖的效率。结果表明,重组枯草芽孢杆菌*** 168/pMA5-EcMIaseA在最适转化条件下进行5 L发酵罐全细胞转化,分别以500 g/L果糖和600 g/L果糖为底物,转化6 h后D-甘露糖的产量分别为138.74 g/L和163.30 g/L,转化率分别达到27.75%和27.22%,这是目前报道的以食品级菌株进行D-甘露糖生产的最高产量。本研究为D-甘露糖的工业化安全生产及应用奠定了重要基础。

关键词： D-甘露糖枯草芽孢杆菌甘露糖异构酶全细胞催化

重组大肠杆菌全细胞催化合成4-羟基异亮氨酸

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食品与生物技术学报 2021年第4期40卷 26-35页

作者： Umutumwa Eric Principe 乔郅钠龙梦飞邵明龙徐美娟杨套伟张显饶志明江南大学生物工程学院/工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学(如皋)食品生物技术研究所江苏南通226500

4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在*** ... 详细信息

4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在*** BL21(DE3)中的异源表达。其次,通过同源建模和蛋白质结构分析,本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成丙氨酸Ala的原则,对I156位点进行了定点突变,以增大底物结合口袋,扩宽底物通遒进而提高4-HIL的产量。最后,对野生酶及突变酶的酶学性质、突变酶的羟基化反应体系进行研究,在最优催化条件下,分批补料转化底物进行4-HIL的生产。酶学性质结果显示,野生酶及突变酶I156A的最适温度均为25℃,最适pH均为7.0;突变酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍,L-ILe转化率提高了28%。羟基化反应体系的最优转化条件为:20 mmol/L L-ILe,20 mmol/Lα-酮戊二酸,8 mmol/L Fe^(2+),30 mmol/L抗坏血酸和HEPES(50 mmol/L,pH 7.0)缓冲液。在最优转化条件下,重组菌*** BL21/pET28a-ido^(I156A)进行分批补料转化底物,时间间隔为4 h,32 h后得到77.3 mmol/L 4-HIL,底物最高转化率98.35%e。

关键词： L-异亮氨酸 L-异亮氨酸羟化酶 4-羟基异亮氨酸定点突变酶学性质催化体系

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产γ-氨基丁酸

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生物工程学报 2023年第6期39卷 2108-2125页

作者：肖杰文韩瑾乔郅钠张国栋黄武军钱凯徐美娟张显杨套伟饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122 仁仁健康产业有限公司江西宜春331200

氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基... 详细信息

氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGADS24R/D88R/Y309K在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与LpgadS24R/D88R/Y309K突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40℃,菌体量OD600=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。

关键词： γ-氨基丁酸谷氨酸脱羧酶 pH改造表面电荷全细胞转化

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某地仿古高层建筑的结构设计

山西建筑 2025年第1期51卷 55-59页

作者：卓郅颖余兴广西壮族自治区城乡规划设计院广西南宁530015 华蓝设计(集团)有限公司广西南宁530012

以位于7度抗震设防区内的某仿古高层建筑为工程背景,介绍了拥有大型坡屋面的仿古高层建筑项目的特点以及在设计中遇到的重、难点问题。该建筑因建筑造型要求导致结构具有大开洞、跃层柱、体型收进、刚度不连续等抗震不利的特点,该项目... 详细信息

以位于7度抗震设防区内的某仿古高层建筑为工程背景,介绍了拥有大型坡屋面的仿古高层建筑项目的特点以及在设计中遇到的重、难点问题。该建筑因建筑造型要求导致结构具有大开洞、跃层柱、体型收进、刚度不连续等抗震不利的特点,该项目采用了YJK结构设计软件进行设计分析,采用合并标准层的设计方法来避免软件出现不合理的薄弱层判定;采用弹性时程分析来补充计算结构顶层因抽柱形成空旷房间的情况。计算结果表明,该项目结构设计合理,经济安全。文中列举了计算结果,分析阐述了针对设计中遇到的重、难点问题的处理方法,如何在设计中调整各设计参数以避免结构被判定为超限建筑,从而实现缩短设计周期并满足现行结构设计技术规范的要求,并对同类型项目提出了设计建议。

关键词：高层建筑弹性时程分析跃层柱体型收进仿古屋盖