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利用多倍体诱导和转基因技术创制芦笋新种质的研究

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利用多倍体诱导和转基因技术创制芦笋新种质的研究

作者：鹿志伟海南大学

学位级别：硕士

芦笋是世界十大名贵蔬菜之一,含有多种活性药用成分以及其它重要的营养成分,素有“蔬菜之王”的美誉。然而随着芦笋种植面积的不断增加,病害、低产等问题也随之出现,严重制约着芦笋产业的长期稳定发展。因此培育抗病、高产的芦笋新品种... 详细信息

芦笋是世界十大名贵蔬菜之一,含有多种活性药用成分以及其它重要的营养成分,素有“蔬菜之王”的美誉。然而随着芦笋种植面积的不断增加,病害、低产等问题也随之出现,严重制约着芦笋产业的长期稳定发展。因此培育抗病、高产的芦笋新品种成为当务之急。本研究针对芦笋抗病、高产的新品种培育的需要,利用多倍体诱导和转基因技术进行了芦笋新种质的研究。主要研究结果如下：1.芦笋多倍体诱导工作中,以“新王朝”和“达宝利”两个芦笋品种的露白种子作为诱导处理对象,以秋水仙素(添加2%DMS0)处理浓度和处理时间作为诱导因子,设计多个梯度的正交试验,研究其对芦笋四倍体诱导率的影响,结果发现最佳的秋水仙素处理组合为：0.15%的秋水仙素(添加2%DMSO)处理16h,诱导率高达31%。经过流式细胞仪和染色体计数法两种方法对四倍体进行鉴定后,发现二倍体芦笋的染色体数目为20条,而四倍体染色体数目为40条;流式细胞仪鉴定结果中,二倍体植株的DNA荧光强度主吸收峰值为四倍体的二分之一;形态学、细胞学和叶绿素含量水平的对比发现,与二倍体相比,四倍体芦笋植株粗壮、叶片长度和直径增加,气孔细胞密度减少,气孔细胞体积增大,叶绿体数目和叶绿体含量增加。2.以“井岗701”芦笋无菌苗作为研究对象,各种不同浓度的植物激素作为诱导因子,设计了一系列的正交试验,最后通过SPSS19.0软件进行结果方差分析,确定了最佳诱导芦笋愈伤组织、胚状体以及芦笋组培苗的激素浓度组合：最佳的芦笋愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D2mg/L+KTlmg/L+25g/L蔗糖+卡拉胶6.5g/L(pH5.8);最佳的芦笋胚状体诱导培养基为MS+4%蔗糖+800mg/L谷氨酰胺+500mg/L酸水解酪素+0.70mg/L嘧啶醇+0.10mg/L NAA+0.50mg/L kinetin+7.0g/L卡拉胶pH5.8;最佳的芦笋组培苗诱导培养基为MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+30g/L蔗糖+卡拉胶6.5g/L(pH5.8)。成苗率达到60%左右。室外移栽成活率高达90%。3.开展了芦笋遗传转化体系建立的研究,成功构建了含有hevein-like基因的pCAMBIA3300植物表达载体,并转入农杆菌EHA105菌株中。并以“井岗701”芦笋胚状体作为侵染对象,研究了最佳的农杆菌转化芦笋胚状体的最佳条件,结果为：预培养2d,菌液浓度OD600=0.6,侵染时间10min,共培养时间4d,AS浓度200μmol/L,对转化芦笋苗进行PCR检测,阳性率为21%。

关键词：芦笋组培多倍体转基因诱导

试述高速公路桥梁工程施工中预应力检测技术的应用

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中国标准化 2018年第24期 181-182页

作者：鹿志伟中铁十一局集团第二工程有限公司

随着工程建设步伐越来越快,人们对高速公路桥梁施工质量也提出了更严格的要求。预应力检测技术是路桥工程一项重要的施工技术,将预应力检测技术合理应用到高速公路桥梁工程施工中,既能确保施工科学,强化工程质量,又能实现路桥寿命的延长... 详细信息

随着工程建设步伐越来越快,人们对高速公路桥梁施工质量也提出了更严格的要求。预应力检测技术是路桥工程一项重要的施工技术,将预应力检测技术合理应用到高速公路桥梁工程施工中,既能确保施工科学,强化工程质量,又能实现路桥寿命的延长,具有良好的综合效益。

关键词：高速公路桥梁工程预应力检测技术应用

CRTSⅢ型板式无砟轨道自密实混凝土的性能分析

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工程建设与设计 2018年第13期 156-157,160页

作者：鹿志伟中铁十一局集团第二工程有限公司湖北十堰442013

以实际工程为例,对自密实混凝土的性能进行分析,重点对CRTSⅢ型板式无砟轨道自密实混凝土的性能进行探讨,解决了其重、难点问题,保证了施工质量,可为类似工程提供借鉴。

关键词：试验配合比体积稳定性能持久性能

外源抗坏血酸对采后菠萝黑心病发生及抗氧化性能的影响

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果树学报 2018年第9期35卷 1105-1116页

作者：侯晓婉鹿志伟张鲁斌贾志伟谷会洪克前中国热带农业科学院南亚热带作物研究所.海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室广东湛江524091

【目的】探讨外源抗坏血酸对采后菠萝果实黑心病发生和抗氧化性能的影响。【方法】以‘巴厘’菠萝为材料,分别用清水和0.2%(m/v)抗坏血酸浸泡处理,研究采后贮藏过程中黑心病发病情况及H2O2含量变化,分析抗氧化物含量和抗氧化物酶活性变... 详细信息

【目的】探讨外源抗坏血酸对采后菠萝果实黑心病发生和抗氧化性能的影响。【方法】以‘巴厘’菠萝为材料,分别用清水和0.2%(m/v)抗坏血酸浸泡处理,研究采后贮藏过程中黑心病发病情况及H2O2含量变化,分析抗氧化物含量和抗氧化物酶活性变化,并结合转录组数据探索关键酶基因的表达情况。【结果】外源抗坏血酸处理有效延缓了采后菠萝黑心病的发生,降低了菠萝果实黑心病病情指数,显著降低了菠萝果实H2O2含量,抑制了内源抗坏血酸(As A)含量的减少,增强了还原型谷胱甘肽(GSH)含量,提高了抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性。在黑心病发生过程中,抗氧化防御系统关键酶基因显著响应抗坏血酸的处理,抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)和谷胱甘肽还原酶基因(GR)均显著上调。【结论】菠萝果实采后贮藏前外源As A处理能够延缓贮藏过程中菠萝果肉As A含量的下降,降低果肉H2O2含量,提高内源GSH抗氧化物含量,同时增加酶促和非酶促抗氧化防御系统中关键酶的活性,增强菠萝果实的抗氧化性能,延缓采后菠萝黑心病的发生,延长采后菠萝贮藏时间。

关键词： '巴厘’菠萝(Ananas comosus'Comtede Paris’) 抗坏血酸黑心病抗氧化能力实时荧光定量PCR

外源抗坏血酸处理对采后菠萝黑心病发生和果实品质的影响

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热带作物学报 2018年第10期39卷 2014-2020页

作者：侯晓婉鹿志伟谷会贾志伟张鲁斌中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室广东湛江524091

为了探明抗坏血酸对菠萝果实采后保鲜的有效性,本研究以"巴厘"菠萝(Ananas comosus cv. Comtede Paris)为材料,分别用0.2%和0.4%(质量体积百分比w/V)的抗坏血酸(L-Ascorbicacid,AsA)浸泡处理,以清水浸泡为对照,0.02mm厚聚乙烯打孔薄膜... 详细信息

为了探明抗坏血酸对菠萝果实采后保鲜的有效性,本研究以"巴厘"菠萝(Ananas comosus cv. Comtede Paris)为材料,分别用0.2%和0.4%(质量体积百分比w/V)的抗坏血酸(L-Ascorbicacid,AsA)浸泡处理,以清水浸泡为对照,0.02mm厚聚乙烯打孔薄膜袋包装后,于常温(25±2)℃、相对湿度85%～95%的水果储藏库中贮藏,观察采后菠萝黑心病发生与果实品质的变化。结果表明:AsA处理有效地延缓菠萝黑心病的发生,保持菠萝果实的硬度,抑制可滴定酸、可溶性固形物和维生素C含量的减少,在贮藏后期能够有效地抑制丙二醛(MDA)的积累。果肉氧化酶活性测定结果表明,0.2%AsA处理可抑制多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO)活性增加,保持较高的过氧化物酶(peroxidase,POD)活性。可见,AsA能够有效地延缓菠萝黑心病的发生,保持采后菠萝的食用品质,抑制采后菠萝果实酚类物质酶促氧化的发生,延缓菠萝贮藏期间的衰老进程,并且0.2%AsA的处理效果优于0.4%AsA的处理效果,因此0.2%AsA为最佳处理浓度。

关键词： “巴厘”菠萝(Ananas comosus cv. Comtede Paris) 抗坏血酸黑心病果实品质氧化酶

剑麻EST-SSR在丝兰麻和中美麻中的通用性分析

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热带作物学报 2021年第7期42卷 1824-1830页

作者：张燕梅李俊峰鹿志伟杨子平周文钊中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/湛江市热带作物遗传改良重点实验室广东湛江524091

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对剑麻‘H.11648’中的100对SSR引物在丝兰麻和万年兰中的通用性进行分析,同时构建DNA指纹图谱。结果表明100对SSR引物,在龙舌兰属、丝兰麻属、中美麻属中分别有68对、52对和52对SSR引物扩增出目标产物条带... 详细信息

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对剑麻‘H.11648’中的100对SSR引物在丝兰麻和万年兰中的通用性进行分析,同时构建DNA指纹图谱。结果表明100对SSR引物,在龙舌兰属、丝兰麻属、中美麻属中分别有68对、52对和52对SSR引物扩增出目标产物条带,扩增产物所占比例分别为68%、52%和52%,多态性引物分别为18对、12对和9对,多态性引物所占比例分别为29.51%、23.08%和17.31%。检测位点数分别为76、44和40个,平均每对引物多态位点数分别为2.67、2.42和2.22个。引物C67656和C61418可将龙舌兰属的6份种质区分开来,引物C65059可将丝兰麻属的5份种质区分开,引物C24110可将中美麻属的4份种质区分开。以上研究结果表明,从‘H.11648’开发的SSR引物在龙舌兰及其近缘属中是可以通用的,筛选出的SSR引物可用于龙舌兰及其近缘属种质资源的鉴定和遗传多样性分析等研究。

关键词：剑麻 EST-SSR 丝兰麻中美麻通用性

菠萝黑心病发生过程中AcAPXs的表达分析及克隆

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热带作物学报 2023年第3期44卷 597-606页

作者：张媛媛鹿志伟李茂富姚全胜侯晓婉海南大学园艺学院海南海口570228 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室广东湛江524091 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

菠萝黑心病(internal browning,IB)严重制约菠萝产业发展,该病害的发生主要是过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)引起膜损伤,打破质体多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)与液泡内酚类底物原有的区室化划分,使其接触氧化后聚合成... 详细信息

菠萝黑心病(internal browning,IB)严重制约菠萝产业发展,该病害的发生主要是过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)引起膜损伤,打破质体多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)与液泡内酚类底物原有的区室化划分,使其接触氧化后聚合成醌类物质。抗氧化清除系统能够清除过量ROS,维持机体内ROS的动态平衡。本课题组前期用抗氧化剂抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)处理采后‘巴厘’菠萝,能有效延缓黑心病的恶化,然而其作用机理尚不明确。抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX,EC1.***.11.1)是I类血红素过氧化物酶,以抗坏血酸作为特定的电子供体,催化过氧化氢转化为水,参与植物的多种发育生理过程和胁迫反应。本研究筛选出6个AcAPX基因,对其黑心病发生过程以及AsA处理后的转录水平进行分析,发现AcAPX1基因在贮藏后期极显著响应AsA处理,9 d和12 d时显著上调表达;相关性分析发现,AsA处理后的菠萝黑心病指数与AcAPX1基因表达水平呈显著正相关。结果表明:AcAPX1显著响应AsA处理,可能在AsA延缓菠萝黑心病中发挥重要作用。为了进一步探究其作用机制,从菠萝果肉中克隆到AcAPX1基因,通过生物信息学分析方法对其理化性质、蛋白结构域等进行分析。结果表明:其开放阅读框长度为753 bp,编码250个氨基酸,蛋白分子量预测为27.41087 kDa,理论等电点为5.52,无跨膜螺旋区,属于稳定亲水性蛋白;氨基酸序列比对分析表明,菠萝AcAPX1与番木瓜、香蕉、椰子、油棕的序列相似性达85%以上,对AcAPX1基因进行功能结构域分析表明其具有血红素结合位点、K^(+)结合位点及底物结合位点(超家族:cl00196),属于植物过氧化物酶超家族的成员。AcAPX1基因的克隆对于研究其在菠萝中抗氧化能力中的分子机制及黑心病的防治具有重要意义。研究结果为进一步探究菠萝AcAPX1基因参与AsA清除ROS,延缓黑心病恶化的分子机制奠定基础。

关键词：菠萝黑心病,抗坏血酸过氧化物酶 qPCR 克隆

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巴西蕉AP2/ERF超家族全基因组分析

热带作物学报 2017年第2期38卷 302-312页

作者：侯晓婉胡伟徐碧玉金志强张鲁斌鹿志伟中国热带农业科学院南亚热带作物研究所海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室广东湛江524091 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101

香蕉作为热带和亚热带发展中国家最重要的粮食和经济作物,其产量和质量受到低温、干旱、高盐等非生物逆境胁迫的严重影响。基于香蕉A基因组测序数据,利用生物信息学技术和方法,对巴西蕉中调控植物非生物逆境胁迫应答方面发挥重要作用的A... 详细信息

香蕉作为热带和亚热带发展中国家最重要的粮食和经济作物,其产量和质量受到低温、干旱、高盐等非生物逆境胁迫的严重影响。基于香蕉A基因组测序数据,利用生物信息学技术和方法,对巴西蕉中调控植物非生物逆境胁迫应答方面发挥重要作用的AP2/ERF超家族基因全基因组进行系统分析。结果表明:共获得119个巴西蕉AP2/ERF超家族基因,并将其划分成ERF(100)、RAV(15)和soloist(4)家族,其中ERF家族又被划分为10个亚家族,每个亚家族基因具有相似的保守motif和基因结构。此研究结果不仅为巴西蕉应答非生物逆境胁迫下AP2/ERF超家族基因功能和响应机制的研究、香蕉品种抗逆改良奠定理论基础,而且也为不同物种的AP2/ERF超家族基因的系统发育和进化研究提供方法和理论依据。

关键词：香蕉 AP2/ERF 全基因组分析

基于转录组的剑麻ARF基因家族的鉴定及表达分析

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热带作物学报 2019年第10期40卷 1972-1978页

作者：鹿志伟侯晓婉杨子平张燕梅李俊峰周文钊中国热带农业科学院南亚热带作物研究所广东湛江524091 湛江市热带作物遗传改良重点实验室广东湛江524091

生长素反应因子(AuxinResponseFactors,ARFs)是植物特有的多基因转录因子家族,参与植物生长发育过程的调节。本研究基于转录组数据,通过生物信息学方法鉴定剑麻ARF基因家族成员,同时对其进行相关生物信息学分析。结果表明:在剑麻中共鉴... 详细信息

生长素反应因子(AuxinResponseFactors,ARFs)是植物特有的多基因转录因子家族,参与植物生长发育过程的调节。本研究基于转录组数据,通过生物信息学方法鉴定剑麻ARF基因家族成员,同时对其进行相关生物信息学分析。结果表明:在剑麻中共鉴定得到15个ARF基因,并依次命名为AhARF1~15。其编码的蛋白质含有409~1011个氨基酸,分子量约为45.17~112.13ku,等电点为5.17~9.34。亚细胞定位预测结果显示,13个AhARFs定位于细胞核,2个AhARFs定位于叶绿体。保守结构域分析结果表明,AhARFs基因家族有8个成员同时含有B3、ARF和Aux/IAA这3个相对保守的结构域,其他成员仅含有B3和ARF这2个结构域。进化树分析表明,剑麻AhARFs蛋白可分为5个亚家族。15个剑麻AhARFs基因在剑麻紫色卷叶病不同发病时期呈现不同的表达规律。本研究为进一步深入探索剑麻ARF基因家族的功能奠定了重要理论基础。

关键词：剑麻 ARF 基因家族转录组