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基于新一代测序和质谱技术联合生物信息学的抗体发现平台研究

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基于新一代测序和质谱技术联合生物信息学的抗体发现平台研究

作者：项海涛华南理工大学

学位级别：硕士

治疗性抗体药物根据结构可分为单克隆抗体、抗体片段、抗体偶联物等,其中单克隆抗体药物占据了最大的市场份额,自从1986年首个抗体药物Orthoclone OKT3获批上市以来,美国食品药品监督管理局(FDA)已累计批准上市了超过70个抗体药物。虽... 详细信息

治疗性抗体药物根据结构可分为单克隆抗体、抗体片段、抗体偶联物等,其中单克隆抗体药物占据了最大的市场份额,自从1986年首个抗体药物Orthoclone OKT3获批上市以来,美国食品药品监督管理局(FDA)已累计批准上市了超过70个抗体药物。虽然单克隆抗体药物自上市以来在临床及商业上取得了巨大的成功,但其研发过程仍然存在诸多挑战,就抗体药物前期研发工作而言,目前主流技术均基于实验手段,其核心是文库筛选,获得高特异性、高亲和力单克隆抗体。主流文库筛选有两大技术平台:噬菌体/酵母展示文库筛选和杂交瘤细胞筛选,但这些平台均存在周期长、成本高、实验过程复杂以及难以大规模生产等限制,面对这些挑战,相关科研和技术人员正在积极开发新的方法,寻找新的技术突破。随着技术的进步,测序成本越来越低,新一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术得以在生物学和转化医学研究的许多领域被广泛应用。近年来,NGS应用的范围已经延伸到B/T细胞免疫组库测序领域,已经有报道尝试将免疫组库测序和蛋白质组学技术结合起来,应用于高亲和力抗体的筛选工作,但目前仍未见充分利用抗体(免疫)组库中的抗体丰度及丰度动态变化信息提高抗体筛选效率的报道。本研究基于对NGS技术和质谱分析技术的充分学习和研究,开发了一套完整的生物信息学分析平台,可以快速、高通量的筛选出具有高度抗原特异性和亲和力的抗体序列。本平台综合分析了多次免疫后抗体组库中抗体的丰度及其动态变化信息,对NGS数据进行质量评估和基本比对分析后,确定各免疫批次中抗体序列的结构信息,如框架区和互补决定区核酸和氨基酸序列信息,统计CDR3序列的丰度数据,以及同一CDR3序列在不同免疫批次中的丰度动态变化情况;并将NGS分析得到的抗体序列作为质谱数据分析的参考序列库,整合免疫后动物血清中抗体质谱数据的分析结果,确定被鉴定到的肽段序列信息以及对应的抗体蛋白序列,获得鉴定肽段在抗体蛋白序列中的位置以及覆盖度信息,进而筛选和分析能够指示抗体-抗原亲和力的各项特征指标,并通过这些指标进行序列评级以筛选最终的抗体。最后,我们从候选抗体中挑选了10条,进行合成和实验验证,结果显示5条为阳性抗体,抗体阳性率达到了50%。相比于传统的抗体药物前期研发平台,本研究中所开发的平台具有易于操作、更快速和更高效的特点,所有数据分析过程仅需一周的时间即可完成,加上前期动物免疫和后期实验验证的时间,整个过程仅需三个月,而目前广泛使用的噬菌体展示平台需要半年左右的时间,因此,相对而言,本平台大大缩短了抗体开发周期,具有很强的市场应用价值。

关键词：免疫组库单克隆抗体新一代测序质谱生物信息学

AsiaⅠ型口蹄疫基因治疗与基因免疫双功能疫苗载体的构建

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AsiaⅠ型口蹄疫基因治疗与基因免疫双功能疫苗载体的构建

作者：项海涛甘肃农业大学

学位级别：硕士

目前,对于口蹄疫的防制主要采用屠杀、隔离和免疫接种,其中疾病流行前的免疫接种是特异性保护家畜免遭感染的有效途径,但现有疫苗接种动物后都会存在免疫空白期,即诱导免疫动物产生体液和细胞免疫反应,等待有效抗体产生的一段时间。动... 详细信息

目前,对于口蹄疫的防制主要采用屠杀、隔离和免疫接种,其中疾病流行前的免疫接种是特异性保护家畜免遭感染的有效途径,但现有疫苗接种动物后都会存在免疫空白期,即诱导免疫动物产生体液和细胞免疫反应,等待有效抗体产生的一段时间。动物如果在这段时间内遭到病毒的入侵往往会引起该病的流行。为探索解决免疫动物在疫苗接种的免疫空白期内发病这一难题,本研究以Asia I江苏株为模板,引入RNA干扰机制,进行了双功能疫苗的探索研究,并取得下述进展:1.对pBudCE4.1载体进行改造,将其CMV启动子替换为U6启动子,成功改造出适合于双功能疫苗研究的双启动子载体pBudCE4.1-U6。2.利用绿色荧光蛋白的表达与沉默表达对载体pBudCE4.1-U6的双启动子分别进行功能效率鉴定,结果表明对载体的改造是成功的,载体pBudCE4.1-U6的两个启动子均能启动目的基因的表达。3.针对Asia I江苏株的3D基因设计3条小RNA干扰片段,并将之与免疫组合基因P12A+3C克隆入双启动子载体pBudCE4.1-U6,成功构建出了3个双功能疫苗质粒。4.双功能疫苗质粒转染靶细胞BHK-21,有延迟细胞病变的作用,说明双功能载体能够转录出siRNA,对病毒的转录复制有一定的抑制效果。5.间接免疫荧光检测结果表明双功能载体能够同时启动口蹄疫免疫基因在BHK-21细胞中的表达。

关键词：双功能疫苗载体 FMDV RNAi pBudCE4.1

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浅析高校入党引导教育工作

教育现代化 2016年第40期 283-285页

作者：项海涛内蒙古机电职业技术学院

加强对高校大学生入党引导教育是高校学生党建工作的一个重要内容,也是高校思想政治教育工作的一个重要方面。通过对学生教育,提高他们的思想政治素质,引导他们端正入党动机,确立正确的政治信仰,对于建设中国特色社会主义现代化建设具... 详细信息

加强对高校大学生入党引导教育是高校学生党建工作的一个重要内容,也是高校思想政治教育工作的一个重要方面。通过对学生教育,提高他们的思想政治素质,引导他们端正入党动机,确立正确的政治信仰,对于建设中国特色社会主义现代化建设具有重大而深远的战略意义。

关键词：高校入党引导教育工作

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民族区域自治权行使中存在的问题以及对策

内蒙古水利 2010年第3期 182-183页

作者：项海涛内蒙古机电职业技术学院内蒙古呼和浩特010070

民族区域自治制度体现了党和国家的民族平等的根本原则,保障了少数民族国家当家作主的自治权利,调动和发挥了少数民族参与建设和维护祖国统一的极为重要的积极作用,使民族区域地方的经济、政治、文化各方面获得了较大的发展。但在我国... 详细信息

民族区域自治制度体现了党和国家的民族平等的根本原则,保障了少数民族国家当家作主的自治权利,调动和发挥了少数民族参与建设和维护祖国统一的极为重要的积极作用,使民族区域地方的经济、政治、文化各方面获得了较大的发展。但在我国开始步入社会市场经济体制以来,特别是加入WTO以后,民族区域自治的运行机制存在着一些问题,这些问题影响到民族自治地方的发展和繁荣。只有实现自治区域的自身完善与时代发展的协调统一,才能发挥其应有的作用。应该加强普法工作,增强民族自治地方公民的自治权意识;尤其是修订《自治法》和健全法制问题;中央应针对民族区域制定相应的优惠政策。

关键词：民族区域自治自治权健全法制优惠政策

互联网时代下的农家乐营销模式分析——以贵州为例

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佳木斯职业学院学报 2020年第6期36卷 49-50页

作者：项海涛贵州大学人武装学院贵州贵阳550025

现代社会人们物质生活品质得到大幅度提高,消费方式更加倾向于健康舒适。在网络技术和信息技术快速发展的背景下,农家乐也随之发展成为人们热衷的一种新兴消费方式。本文主要以互联网时代的贵州农家乐为主题展开分析,以农家乐内涵为切入... 详细信息

现代社会人们物质生活品质得到大幅度提高,消费方式更加倾向于健康舒适。在网络技术和信息技术快速发展的背景下,农家乐也随之发展成为人们热衷的一种新兴消费方式。本文主要以互联网时代的贵州农家乐为主题展开分析,以农家乐内涵为切入点,在具体分析贵州农家乐消费特点的基础上,深入分析农家乐经营方面的不足,进一步探讨互联网时代下贵州农家营销模式的良策,以期为促进贵州农家乐稳健、长远发展提供具有参考价值的建议。

关键词：互联网时代贵州农家乐营销模式

高职院校“校企合作、工学结合”人才培养模式改革中面临的问题及对策

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语文学刊(教育版) 2010年第11期 159-161页

作者：项海涛内蒙古机电职业技术学院党政办

本文指出"校企合作、工学结合"人才培养模式是高等职业技术教育可持续发展的必由之路,剖析了"校企合作、工学结合"人才培养模式改革过程中存在的问题和阻滞因素,提出了若干促进我国"校企合作、工学结合"人才培养模式改革的对策建议。

关键词：校企合作工学结合人才培养

多房棘球绦虫apomucin基因qPCR引物的筛选及潜在应用

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2016年第5期34卷 394-398页

作者：苏梦郭小腊杨静邵忠伟丁军涛项海涛骆学农郑亚东孙晓林甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃动物寄生虫病重点实验室兰州730046 新疆大学生命科学与技术学院乌鲁木齐830046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

目的筛选多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）apomucin基因（Em-apo）的qPCR最佳引物，探索该基因的表达水平。方法根据GeneDB中4种Em-apo序列，设计引物并通过荧光定量PCR（qPCR）对引物进行分析，确定每对引物的特异性、... 详细信息

目的筛选多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）apomucin基因（Em-apo）的qPCR最佳引物，探索该基因的表达水平。方法根据GeneDB中4种Em-apo序列，设计引物并通过荧光定量PCR（qPCR）对引物进行分析，确定每对引物的特异性、PCR扩增效率。利用筛选得到的最佳引物，分别检测经阿苯达唑（5 μg/ml）和胰岛素（100 ng/ml）培养处理的多房棘球绦虫原头节（1 000个）Em-apo表达水平的变化，用稀释阿苯达唑的DMSO和胰岛素的PBS作为各自的对照。结果筛选分别得到了Em-apo-1、Em-apo-2/3、Em-apo-4和内参基因actin的特异引物各1对，qPCR熔解曲线分析结果显示，每对引物的扩增产物只出现单峰，且扩增效率均为95%～101%。qPCR分析结果显示，与DMSO对照组（1.00）相比，多房棘球绦虫原头节经阿苯达唑处理后，Em-apo-1、Em-apo-2/3和Em-apo-4的表达水平均有所上升，分别为1.51±0.27、1.39±0.30和1.14±0.18，三者差异无统计学意义（P〉0.05）；与PBS对照组（1.00）相比，原头节经胰岛素处理后，Em-apo表达水平的变化不一，其中Em-apo-1的表达水平基本不变，Em-apo-4的表达水平有所下降，而Em-apo-2/3明显下调（0.73±0.09），但三者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论本实验筛选确定的Em-apo基因的qPCR引物特异，可用于Em-apo基因表达水平的检测。多房棘球绦虫原头节经阿苯达唑和胰岛素处理后，对Em-apo-1、Em-apo-2/3和Em-apo-4的表达水平有一定的影响。

关键词：多房棘球绦虫 apomucin基因 qPCR 阿苯达唑胰岛素

牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶基因的克隆表达及表达产物酶比活性的测定

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中国兽医科学 2015年第9期45卷 896-901页

作者：李娜包世俊苏炜德邢小勇伏小平温峰琴项海涛薛慧文甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

参照GenBank中牛支原体PG45株二氢硫辛酸脱氢酶基因(pdhD)的序列设计特异性引物,应用PCR扩增牛支原体武威株的pdhD基因,然后将其克隆至pMD19-T。在完成测序及点突变的基础上构建重组表达质粒pET-28a(+)-pdhD,转化大肠杆菌BL21(DE3),经I... 详细信息

参照GenBank中牛支原体PG45株二氢硫辛酸脱氢酶基因(pdhD)的序列设计特异性引物,应用PCR扩增牛支原体武威株的pdhD基因,然后将其克隆至pMD19-T。在完成测序及点突变的基础上构建重组表达质粒pET-28a(+)-pdhD,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后纯化表达产物His-DLD,并对其酶促反应活性进行测定。结果显示,表达产物在底物NADH存在条件下,能将硫辛酰胺催化生成二氢硫辛酰胺,且其最适酶促反应温度为25℃、pH为7.5;其米氏常数Km(NADH)为9.72μmol/L,最大反应速率为25.6μmol/(L·min)。上述结果为研究二氢硫辛酸脱氢酶的生物学功能奠定了基础。

关键词：牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶基因原核表达

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段的表达、纯化及抗原性分析

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中国兽医学报 2012年第2期32卷 231-237页

作者：郝宝成梁剑平兰喜刑小勇项海涛温峰琴胡永浩柳纪省中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所新兽药重点开放实验室甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学学院甘肃兰州730070

根据已克隆的戊型肝炎病毒株swCH189株结构蛋白基因(ORF2)的抗原性及水溶性分析,在其序列上设计套式引物,采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒(HEV)结构蛋白基因ORF2主要抗原基因片段,长度为728bp,将其克隆于PMD18-T载体,测序结果表明插... 详细信息

根据已克隆的戊型肝炎病毒株swCH189株结构蛋白基因(ORF2)的抗原性及水溶性分析,在其序列上设计套式引物,采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒(HEV)结构蛋白基因ORF2主要抗原基因片段,长度为728bp,将其克隆于PMD18-T载体,测序结果表明插入的片段属于猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因ORF2部分;将该片段插入pet32a表达载体,经酶切、测序鉴定证实获得了带有目的基因的重组表达质粒。将重组质粒转化Rosetta菌,经0.3mmol/L IPTG诱导得到融合表达,得到相对分子质量为45 000的重组蛋白,以包涵体形式存在。Western blot分析表明,该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。并用SDS电泳切胶纯化和透析浓缩方法进行纯化,用纯化的蛋白免疫兔子,经每2周免疫1次,连续3次免疫后,对免疫组和对照组,分别在45,60,90d采血,每只兔子采集1份。用夹心ELISA法测定免疫血清抗体,结果表明免疫组在45d后均产生具有HEV抗原结合活性的抗体。本试验对猪swCH189株CP239基因的克隆和表达研究,为进一步研究结构蛋白基因ORF2的生物学功能奠定了基础。

关键词：猪戊型肝炎病毒 swCH189株克隆原核表达纯化抗原性分析