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犬圆环病毒检测方法建立及分子流行病学调查

犬圆环病毒检测方法建立及分子流行病学调查

作者：韩知晓广西大学

学位级别：硕士

犬圆环病毒(Canine CV)属圆环病毒科圆环病毒属,是一种可引发犬出血性胃肠炎、坏死性血管炎、肉芽肿性炎症和淋巴坏死的新型哺乳类动物圆环病毒,严重危害犬科动物的健康。为了解我国Canine CV的流行动态和遗传多样性,本试验首先针对病毒... 详细信息

犬圆环病毒(Canine CV)属圆环病毒科圆环病毒属,是一种可引发犬出血性胃肠炎、坏死性血管炎、肉芽肿性炎症和淋巴坏死的新型哺乳类动物圆环病毒,严重危害犬科动物的健康。为了解我国Canine CV的流行动态和遗传多样性,本试验首先针对病毒Rep基因建立Canine CV SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并对广西壮族自治区、广东省、四川省、重庆市、上海市、江苏省、山东省、吉林省、内蒙古自治区、北京市共1666份犬血清样品;其他犬科动物包括辽宁省37份狐狸粪便样品、13份貉粪便样品;广西壮族自治区共38份猫粪便样品进行检测,然后对Canine CV阳性样品DNA进行全基因组扩增,利用生物信息学软件进行同源性分析并构建系统进化树,对我国大陆地区Canine CV进行遗传进化分析。最后为深入研究Rep蛋白的功能,将Canine CV Rep基因克隆到原核表达载体p ET28a构建重组表达质粒,尝试对Rep蛋白进行原核表达。结果显示:试验建立的Canine CV SYBR GreenⅠreal-time PCR方法的Ct值与标准品在6.18×10～9～6.18×10～2copies/μL范围内呈良好的线性关系,其相关性为0.998,斜率为-3.671;检测敏感度为6.18×10～1copies/μL,且对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、狂犬病病毒等均无特异性扩增;所有稀释度标准品模板均在86.45℃出现特异性熔解峰。以上结果表明本试验所建立的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法具有良好的敏感性和特异性,可以满足临床快速检测需要。对全国10个省市(自治区、直辖市)的犬血清样品以及其他犬科动物、猫粪便样品进行检测。结果显示:犬血清样品检测阳性率为5.82%(97/1666),并未在其他动物组织样品中检测到Canine CV。成功获得64个Canine CV中国流行毒株全基因组序列,毒株之间同源性为85.6%～100%,与71条参考毒株序列同源性为78.3%～100%,根据ORF2基因可分为Canine CV-1与Canine CV-2两个主要的基因型和8个基因亚型(1a、1b、1c、1d和2a、2b、2c、2d),其中2c和2d是本研究新发现的基因亚型。使用RDP4软件对病毒基因组进行重组分析,发现重组事件分布于整个Canine CV基因组中。成功构建原核表达载体质粒p ET-28a-Rep,将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,收集菌体蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测,可在35 Ku处检测到重组蛋白目的条带,可见其主要以包涵体形式表达。经Western blotting检测,Rep重组蛋白可以被一抗所识别,而对照组无特异性反应,表明Rep重组蛋白已获得正确表达。本试验成功建立了针对Canine CV Rep基因的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,实现对Canine CV快速、灵敏及准确的诊断。完成了我国10个省(市、自治区)Canine CV的分子流行病学调查和遗传进化分析,丰富Canine CV流行本地和遗传变异数据。另外,成功实现Canine CV Rep蛋白的原核表达,为新型血清学检测方法的建立及亚单位疫苗的研发奠定了基础。

关键词：犬圆环病毒 Rep基因实时荧光定量PCR 基因进化原核表达

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深刻的现代感

服装设计师 2011年第11期 110-113页

作者： Serge Carreira 韩知晓（译）

在近十年间，Felipe Oliveira Baptista悄悄地凭借其简练而又极具现代感的时装系列被誉为巴黎时尚舞台上的主导人物之一。2010年他被任命为Lacoste的创意总监．而2011年9月他为Lacoste设计的第一个服装系列在纽约一经发布．就得到了国... 详细信息

在近十年间，Felipe Oliveira Baptista悄悄地凭借其简练而又极具现代感的时装系列被誉为巴黎时尚舞台上的主导人物之一。2010年他被任命为Lacoste的创意总监．而2011年9月他为Lacoste设计的第一个服装系列在纽约一经发布．就得到了国际媒体的大力称赞。

关键词：现代感服装系巴黎纽约时尚时装

博物馆进校园——湖北省博物馆宣教互动文创产品的开发与研究

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美术教育研究 2022年第16期 95-97页

作者：王伟韩知晓孟宇潇武汉科技大学艺术与设计学院

该文从湖北省博物馆文创产品现状出发,通过对博物馆人流量、受众年龄的分析,探索基于湖北省博物馆楚文化和青少年群体特征的宣教互动文创产品设计。现阶段,湖北省博物馆可着手设计的宣教系列文创产品有三种类别:基于味觉的文化感知类文... 详细信息

该文从湖北省博物馆文创产品现状出发,通过对博物馆人流量、受众年龄的分析,探索基于湖北省博物馆楚文化和青少年群体特征的宣教互动文创产品设计。现阶段,湖北省博物馆可着手设计的宣教系列文创产品有三种类别:基于味觉的文化感知类文创产品、基于视觉的实用类文创产品、基于触觉的触摸交互类文创产品。这有助于湖北省博物馆文创产品更加“贴近青少年的认知与喜好,贴近校园与中小学生的日常生活,被众多的青少年接受和认可”。

关键词：博物馆青少年认知宣传教育文创产品

猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2019年第7期49卷 834-840页

作者：辛佳亮汪伟杜倩韩知晓闭璟珊曹亮孙文超方志超郑敏广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心广西南宁530000 温州大学病毒学研究所浙江温州325035 军事科学院军事兽医研究所吉林长春130122 广西扬翔股份有限公司广西贵港537100

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoVM基... 详细信息

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoVM基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10^8~6.57×10^1copies/L范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10^1copies/L;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。

关键词：猪德尔塔病毒 SYBRGreenⅠ 荧光定量PCR

猪德尔塔冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

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中国动物传染病学报 2021年第2期29卷 15-21页

作者：杜倩汪伟韩知晓孔子荣辛佳亮闭璟珊曹亮孙文超胡传活郑敏广西大学动物科学技术学院南宁530004 广西壮族自治区动物疫病控制中心南宁530000 军事科学院军事兽医研究所长春130122 温州大学病毒学研究所温州325035

为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方... 详细信息

为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析。结果显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×10^(1)~6.26×10^(8)copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×10^(1)copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0%;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6%。结果表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 S基因 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR

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重庆地区犬圆环病毒检测及序列分析

中国畜牧兽医 2020年第10期47卷 3069-3077页

作者：闫修魁韩知晓杜倩汪伟朱远致辛佳亮易驰喆闭璟珊孙文超郑敏广西大学动物科学技术学院南宁530001 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心南宁530004 军事科学院军事兽医研究所长春130122 柳州市工人医院柳州545005 温州大学病毒学研究所温州325035

本试验旨在调查近年来新发的犬圆环病毒(canine circovirus,CCV)在重庆地区的流行情况,探索重庆流行毒株的特性。本研究利用PCR方法对2017年采集于重庆地区的100份犬血清样品进行CCV核酸检测,对所得CCV阳性样品进行全基因组扩增与测序,... 详细信息

本试验旨在调查近年来新发的犬圆环病毒(canine circovirus,CCV)在重庆地区的流行情况,探索重庆流行毒株的特性。本研究利用PCR方法对2017年采集于重庆地区的100份犬血清样品进行CCV核酸检测,对所得CCV阳性样品进行全基因组扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 6.0和RDP4等软件对分离到的重庆CCV毒株进行分析。结果显示,重庆地区100份犬血清中共有4份为CCV阳性,阳性率为4%,从4份阳性样品中共获得3株不同的CCV基因组(CQ76、CQ79和CQ82),全长基因组序列均为2062 nt,与此前报道长度为2063 nt的CCV基因组相比缺少了一个碱基,该碱基位于5′-基因间隔区内茎环结构的下游。3个毒株的两个ORF之间5′末端间隔区和3′末端间隔区长度分别为134(1929-2062 nt)和203 nt(913-1115 nt)。CQ76、CQ79和CQ82的同源性在99.8%~100%之间,其中CQ76与CQ82仅在第2019位点存在同义突变;所获得的3个重庆毒株与国内外报道的其他CCV基因组序列同源性为82.7%~97.1%,其中,ORF2的变异程度大于ORF1。基于病毒ORF2序列和全基因组分别构建NJ进化树中,CQ76、CQ79和CQ82均属于同一亚群,与属于基因Ⅱ型的中国毒株204株遗传距离较近,同源性为96.5%~96.7%。RDP4重组分析发现,CQ76、CQ79和CQ82毒株基因组均为广西毒株204株和388株的重组序列,重组区域坐落于ORF2。本研究为丰富CCV流行病学和遗传进化信息,以及进一步防控研究提供基础数据。

关键词：犬圆环病毒(CCV) 序列分析同源性分析

痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2020年第4期50卷 430-436页

作者：汪伟杜倩韩知晓辛佳亮孔子荣闭璟珊曹亮孙文超胡传活郑敏广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心广西南宁530000 军事科学院军事兽医研究所吉林长春130122 温州大学病毒学研究所浙江温州325035

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试... 详细信息

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×10^9~7.58×10^2copies/μL范围内呈良好线性关系,R^2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性。临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高。结果表明,建立的痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段。

关键词：痘苗病毒 SYBR GreenⅠ 荧光定量PCR

登革病毒SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法的建立及应用

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中国兽医科学 2020年第11期50卷 1353-1359页

作者：汪伟于宁刘宇梦李成辉韩知晓杜倩孙文超鲁会军金宁一广西大学动物科学技术学院广西南宁530001 军事科学院军事兽医研究所吉林长春130122 延边大学农学院吉林延吉133000 温州大学病毒研究所浙江温州325035

为建立灵敏、高效的登革病毒检测方法,本试验拟以包含登革病毒3′端保守序列的质粒pUC57-DENV为模板,建立检测DENV的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在4.88×10^1~4.88×10^9copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,... 详细信息

为建立灵敏、高效的登革病毒检测方法,本试验拟以包含登革病毒3′端保守序列的质粒pUC57-DENV为模板,建立检测DENV的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在4.88×10^1~4.88×10^9copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.653。最低检测限度为4.88 copies/μL,对照组未出现特异性扩增,所有稀释度的标准品在80.20℃出现特异性熔解峰。组内和组间试验的变异系数均小于1%。本试验建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,可为登革病毒早期检测提供技术支持。

关键词：登革病毒 SYBR GreenⅠreal-time PCR 检测方法

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广西猪细小病毒6型分子流行病学调查

中国兽医学报 2020年第6期40卷 1096-1100页

作者：汪伟杜倩韩知晓辛佳亮孙文超曹亮田明尧鲁会军金宁一广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心广西南宁530000 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所吉林长春130122 温州大学病毒学研究所浙江温州325035

为了解广西壮族自治区是否存在猪细小病毒6型(PPV6)毒株,分析其分子特征和遗传进化,本研究利用PCR技术对广西壮族自治区的猪血清临床样本进行检测。结果表明,广西壮族自治区猪群有PPV6的存在,感染率为18.5%(25/135),与PCV2的共感染率为2... 详细信息

为了解广西壮族自治区是否存在猪细小病毒6型(PPV6)毒株,分析其分子特征和遗传进化,本研究利用PCR技术对广西壮族自治区的猪血清临床样本进行检测。结果表明,广西壮族自治区猪群有PPV6的存在,感染率为18.5%(25/135),与PCV2的共感染率为24.0%(6/25)。与参考毒株的NS1核苷酸同源性为99.4%~99.6%;NS1遗传进化分析表明,GX44毒株和GX3-3毒株与中国参考毒株TJ株、韩国KSU1-AZ-2014株、波兰P15-1株同处一个亚群,而美国U18-9株属于另一个亚群。这一研究结果将为中国PPV6毒株的流行病学调查与分析提供最基础的研究资料。

关键词：猪细小病毒6型 PCV2 NS1 遗传进化