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猪流行性腹泻病毒G1/G2型RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

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动物医学进展 2020年第6期41卷 38-41页

作者：王若木孙连静赵硕钟莲袁婷婷陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院广西南宁530005

为建立一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)G1型/G2型感染的RT-PCR方法,基于PEDV的S基因和E基因序列分别设计了PEDV的分型引物和鉴别引物,经过敏感性试验、重复性试验等一系列反应条件的优化,成功建立了鉴别PEDV G1/G2型感染的双重RT-PC... 详细信息

为建立一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)G1型/G2型感染的RT-PCR方法,基于PEDV的S基因和E基因序列分别设计了PEDV的分型引物和鉴别引物,经过敏感性试验、重复性试验等一系列反应条件的优化,成功建立了鉴别PEDV G1/G2型感染的双重RT-PCR方法;通过目的片段的数量来判断PEDV的感染类型,其中,PEDV G1型感染可扩增得到一条目的片段(249 bp),G2型感染扩增得到两条目的片段(840 bp和249 bp)。利用该方法对采自广西不同地区的92份临床样品进行检测,结果显示,阳性样品55份,其中,G2型样品53份,G1型样品2份。结果表明该方法操作简易,具有良好的敏感性和特异性,能快速鉴别PEDV G1/G2型的感染。

关键词：猪流行性腹泻病毒 G1型 G2型反转录-聚合酶链反应鉴别方法

猪德尔塔冠状病毒CHN/20GXNN-1/2020分离鉴定及遗传进化分析

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动物医学进展 2023年第1期44卷 12-18页

作者：速雪丽秦毅斌陆颖杜琛赵武何颖陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院/广西高校动物疫病预防与控制重点实验室广西南宁530005 广西壮族自治区兽医研究所广西南宁530005 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心广西南宁530005 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室广西南宁530005

为了解广西地区猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的流行特点,对该地区PDCoV进行分离鉴定及遗传进化分析。将20份检测为PDCoV阳性的样品接种于LLC-PK细胞,经RT-PCR及IFA鉴定,获得1株PDCoV,命名为CHN/20GXNN-1/2020。通过TCID50和RT-qPCR测定,该... 详细信息

为了解广西地区猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的流行特点,对该地区PDCoV进行分离鉴定及遗传进化分析。将20份检测为PDCoV阳性的样品接种于LLC-PK细胞,经RT-PCR及IFA鉴定,获得1株PDCoV,命名为CHN/20GXNN-1/2020。通过TCID50和RT-qPCR测定,该毒株的病毒滴度及病毒载量在连续传代过程中逐步增高。其S基因核苷酸在153 bp-155 bp位置存在3 bp的缺失,氨基酸有23个位点发生突变。S基因同源性分析结果表明,PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020与中国多数流行毒株的亲缘关系更近。结果表明,分离鉴定出1株新的PDCoV毒株,为冠状病毒生物学特性研究提供了材料,也为进一步开展病毒致病性研究及疫苗研制奠定了基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒分离鉴定 S基因遗传进化分析

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国动物传染病学报 2022年第1期30卷 120-126页

作者：农作荣王豪牛晨霞全东群曾悦任同伟王玉旭陈樱欧阳康黄伟坚韦祖樟广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室南宁530005

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新发传染病病原。研究旨在对SVA的衣壳蛋白VP1进行原核表达,并制备其多克隆抗体。以SVA广西分离株SVA-GX01(GenBank登录号:MK039162)RNA为模版,通过RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,构建重组质粒pET-32a-VP1并转化... 详细信息

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新发传染病病原。研究旨在对SVA的衣壳蛋白VP1进行原核表达,并制备其多克隆抗体。以SVA广西分离株SVA-GX01(GenBank登录号:MK039162)RNA为模版,通过RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,构建重组质粒pET-32a-VP1并转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。在非变性条件下,将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。纯化的多克隆抗体进行间接ELISA测定效价,同时进行Western blot与间接免疫荧光分析。结果表明,重组蛋白pET-32a-VP1在大肠杆菌BL21(DE3)以可溶性与包涵体两种形式表达,分子量约为49 kDa。纯化后多克隆抗体效价高达1∶64000。Western blot与间接免疫荧光(IFA)分析显示,多克隆抗体能跟SVA抗原特异性结合。重组SVA-VP1蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。

关键词： A型塞内卡结构蛋白 VP1 原核表达多克隆抗体

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猪肠病毒G型3C蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

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中国兽医科学 2023年第1期53卷 71-77页

作者：罗允燕黄诗婷曾德平洪大林米雪陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院动物疫病预防与控制重点实验室广西南宁530005 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心广西南宁530005 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室广西南宁530005

为制备猪肠病毒G型(EV-G)非结构蛋白3C的多克隆抗体,本研究参考EV-G分离株CH/17GXQZ/2017的序列设计带有酶切位点的引物扩增3C全基因,通过RT-PCR扩增,将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-EVG-3C。将重组质粒转化至BL21(... 详细信息

为制备猪肠病毒G型(EV-G)非结构蛋白3C的多克隆抗体,本研究参考EV-G分离株CH/17GXQZ/2017的序列设计带有酶切位点的引物扩增3C全基因,通过RT-PCR扩增,将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-EVG-3C。将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞中,通过对诱导条件(诱导温度、IPTG浓度以及诱导时间)的筛选,获得重组3C蛋白的最优表达条件。将表达纯化后的3C蛋白通过皮下注射的方式免疫新西兰大白兔,制备3C蛋白多克隆抗体,通过间接ELISA测定效价,并利用间接免疫荧光试验及Western-blot进行验证。结果显示,表达的3C蛋白主要以包涵体的形式存在,相对分子质量约为38.8 ku;经间接ELISA方法测定,制备的EV-G兔抗效价达到1∶8192000;间接免疫荧光试验和Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能与EV-G特异性结合,具有良好的免疫原性和反应性。本研究为EV-G的诊断以及3C蛋白的功能研究提供了参考。

关键词：猪肠病毒G型 3C蛋白原核表达多克隆抗体

一例猪流行性腹泻病毒与猪肠道病毒9型、猪嵴病毒混合感染的诊断与分析

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黑龙江畜牧兽医 2019年第18期 74-76,183页

作者：龙凤李剑锋钟莲吴雨殊黄丽非秦桂清王贺杰陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康崇左市动物疫病预防控制中心广西崇左532200 广西大学动物科学与技术学院南宁530005

2018年初崇左市某家庭式养猪场发生腹泻疫情,初生仔猪水样腹泻,呕吐,脱水,消瘦,形成僵猪,大量死亡。为调查此次疫情发生的原因,试验通过临床剖检和实验室PCR/RT-PCR检测来进行分析。结果表明:临床剖检病变主要集中在小肠部位,肠系膜淋... 详细信息

2018年初崇左市某家庭式养猪场发生腹泻疫情,初生仔猪水样腹泻,呕吐,脱水,消瘦,形成僵猪,大量死亡。为调查此次疫情发生的原因,试验通过临床剖检和实验室PCR/RT-PCR检测来进行分析。结果表明:临床剖检病变主要集中在小肠部位,肠系膜淋巴结肿大、充血,肠壁变薄。实验室检测发现存在猪流行性腹泻病毒、猪肠道病毒9型和猪嵴病毒的混合感染。结合本病例的流行病学数据、剖检病变及实验室检测结果,认为此次疫情主要由猪流行性腹泻病毒感染引起,部分病猪同时还感染猪肠道病毒9型和猪嵴病毒。说明应加强生物安全和提高仔猪免疫力以预防仔猪腹泻。

关键词：猪流行性腹泻病毒猪肠道病毒9型猪嵴病毒混合感染诊断

1株多谱系毒株重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定和遗传变异分析

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中国兽医学报 2022年第11期42卷 2164-2170,2180页

作者：王新东张康庞燕丽黄稳妃莫清荣黄静陈樱欧阳康黄伟坚韦祖樟广西大学动物科学技术学院广西南宁530005 广西农业职业技术大学动物科学技术系广西南宁530007

从发病猪肺脏组织中检出猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),将毒株命名为GXGG202007。对该毒株进行了病毒的分离以及全基因组测序、遗传演化分析和重组分析。结果显示GXGG202007毒株... 详细信息

从发病猪肺脏组织中检出猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),将毒株命名为GXGG202007。对该毒株进行了病毒的分离以及全基因组测序、遗传演化分析和重组分析。结果显示GXGG202007毒株全基因组为15517个核苷酸(nt);基于ORF5、nsp2和全基因组构建的系统发育树均显示该毒株处于谱系3分支;同源性分析表明其与QYYZ毒株的相似性最高(91.4%),与欧洲株Lelystad-virus(LV)相似性最低(60.3%);通过多种生物信息学软件的重组分析显示,该毒株存在4个重组事件,是1株以谱系3代表毒株QYYZ为骨架,谱系8毒株和谱系5毒株提供重组片段的多谱系重组毒株,其中与HP-PRRSV-like毒株和RespPRRS MLV-like毒株可能分别在42~2008,6884~8549,13061~13853,8550~9523 nt处发生了重组,重组断点位于基因组的nsp2、nsp9和ORF3中。

关键词： PRRSV 分离重组遗传演化分析

猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国兽医科学 2022年第11期52卷 1373-1378页

作者：秦秋英速雪丽黄诗婷秦毅斌何颖卢冰霞陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室广西南宁530005 广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530005

针对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的N基因建立检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示,本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪肠病毒、伪狂犬病病毒、猪... 详细信息

针对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的N基因建立检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示,本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪肠病毒、伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪星状病毒等病原无交叉反应。本方法C_(t)值与标准模板浓度在10^(8.5)~10^(3.5)PFU/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9949,直线方程为y=-3.5949x+41.006,最低检测限为10^(2.50)PFU/mL。运用该方法检测PDCoV感染不同来源细胞系的病毒载量,发现的PDCoV感染宿主谱广,能感染不同来源的细胞,且在LLC-PK细胞上的复制能力最强。本研究建立的方法为PDCoV的防控提供了技术支持。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 N基因荧光定量PCR LLC-PK细胞

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广西地区犬和猫肠道病毒的病原学调查研究

中国兽医杂志 2024年第8期60卷 24-31页

作者：黎波宏黄馨何庆元方友桥满婷婷陈建材周华波韦祖樟欧阳康黄伟坚陈樱广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 南宁市华波宠物医院广西南宁530004 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心广西南宁530004 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室广西南宁530004

为了解引起广西地区犬和猫腹泻等肠道病原的分布情况,并探究犬和猫新型肠道病毒感染的临床特征,为临床中及早诊治和防控肠道疾病提供参考依据,本试验采集宠物犬和猫粪便拭子样品394份(犬样品172份,猫样品222份),并通过聚合酶链式反应(P... 详细信息

为了解引起广西地区犬和猫腹泻等肠道病原的分布情况,并探究犬和猫新型肠道病毒感染的临床特征,为临床中及早诊治和防控肠道疾病提供参考依据,本试验采集宠物犬和猫粪便拭子样品394份(犬样品172份,猫样品222份),并通过聚合酶链式反应(PCR)或反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)筛查犬细小病毒(CPV)、猫瘟病毒(FPV)和查帕马细小病毒(ChPV)等13种主要犬和猫肠道病毒,并分析肠道病毒阳性率与年龄、性别、免疫状况和临床症状之间的相关性。结果显示,犬粪便样品中总阳性样品数为49份,占比28.49%;其中CPV的阳性率最高,达到15.12%,临床症状为典型的肠道症状;其次,犬粪便样品中还检测到犬冠状病毒(CCoV,4.65%)、猫杯状病毒(FCV,4.07%)、嵴病毒(KoV,4.07%)、博卡病毒(BoV,3.49%)、犬瘟热病毒(CDV,2.91%)和布法病毒(BuV,0.58%);其中11份粪便样品混合感染了2种及以上种类的肠道病毒,CPV感染占10份。幼龄犬对CCoV和FCV比较易感;各肠道病毒阳性率与性别无相关性,部分肠道病毒阳性率与免疫状况和临床症状有相关性。猫粪便样品中总阳性样品数为32份,占比14.41%;FPV的阳性率最高,达到8.11%;其次,猫粪便样品中还检测到新型肠道病毒,包括FCV(4.05%)、ChPV(1.35%)、BoV(1.35%)、BuV(0.45%)和猫冠状病毒(FCoV,0.45%);其中混合感染样品仅4份,而FCV感染占3份。FPV和BoV阳性率与猫的年龄和免疫状况存在相关性,各肠道病毒阳性率与猫的性别和临床症状无明显相关性。值得关注的是,犬和猫粪便中均可检测到A型流感病毒(IAV),阳性率分别为2.91%和0.45%。综上表明,CPV和FPV仍是引起犬和猫肠道疾病的主要病原,同时也是混合感染的重要组成;多种新型肠道病毒的阳性率虽然不高,但仍是引起肠道或肠外疾病中不可忽视的病原;IAV的检出再次强调了犬和猫作为“中间宿主”的重要作用。本试验结果不仅为犬和猫肠道传染病的防控提供预警,也为切断宠物-人IAV传播提供重要参考。

关键词：犬和猫粪便样品肠道病毒混合感染流行病学调查

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免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定

免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定