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应用酵母双杂交系统初步筛选与SARS-CoV解旋酶相互作用的细胞蛋白

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应用酵母双杂交系统初步筛选与SARS-CoV解旋酶相互作用的细胞蛋白

作者：陈金烟福建医科大学

学位级别：硕士

SARS冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)为正链RNA病毒，病毒解旋酶(Helicase，HEL)对SARS-CoV在宿主细胞内复制和增殖是必不可少的。HEL的部分生物学特性已有相关的研究报道，但维持HEL活性的细胞辅... 详细信息

SARS冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)为正链RNA病毒，病毒解旋酶(Helicase，HEL)对SARS-CoV在宿主细胞内复制和增殖是必不可少的。HEL的部分生物学特性已有相关的研究报道，但维持HEL活性的细胞辅助因子、HEL是否具有致病作用等尚未有研究报道。为此，本研究拟采用酵母双杂交系统对大鼠肺上皮细胞文库进行筛选，以期获得与HEL相互作用的蛋白质信息，为研究HEL的作用机制提供线索。本研究第一部分旨在排除SARS-CoV HEL的自激活作用，为后续的酵母双杂交实验打下基础。为此，将pGBKT7-HEL(克隆有HEL基因的重组pGBKT7诱饵载体)转化酵母AH109细胞，首先以Western Blot检测融合蛋白，证实HEL蛋白可在AH109细胞中表达，随后通过滤纸法定性检测酵母胞内β半乳糖苷酶活性证明HEL蛋白无自激活作用。本研究第二部分将pGBKT7-HEL和来源于大鼠eDNA的猎物文库质粒顺序转化酵母AH109细胞，通过营养缺陷培养基进行阳性克隆的挑取。随后将顺序转化所得133个克隆通过三轮营养筛选、酶切鉴定、β-半乳糖苷酶活性检测、一对一酵母双杂交系统的回复性实验确认、测序验证筛除假阳性，最后用Blast软件进行同源性分析研究所筛到的相关蛋白质的信息。通过多重验证，最后确定7种相关蛋白，分别为Actn2(Actinin alpha 2)、Bcas2(Breast carcinoma amplified sequence 2)、Thap 11(Thr-His-Ala-Pro domain containing 11)、Ada(Adenosine deaminase)、Ddx5(Asp-Glu-Ala-Asp box polypeptide 5)、Dars2(Aspartyl- tRNA synthetase 2)及Smarcb 1(SWI／SNF related，matrix associated，actin dependent regulaor of chromatin，subfamily b，member 1)。总之，本研究初步确定7种与HEL相互作用的大鼠肺上皮细胞蛋白，但这些细胞蛋白的最终确认，以及它们与HEL的相互作用及机制均有待进一步研究。

关键词： SARS-CoV Heliease 酵母双杂交蛋白

乳腺癌化疗致周围神经病变的列线图模型构建与评价

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中国现代医生 2022年第33期60卷 56-59页

作者：林雅芳邱爱钗陈金烟福建医科大学附属肿瘤医院福建省肿瘤医院乳腺肿瘤内科福建福州350014

目的探讨乳腺癌患者化疗致周围神经病变(chemotherapy-induced peripheral neuropathy,CIPN)的影响因素,建立预测CIPN的列线图模型。方法选择2019年7月至2022年1月福建省肿瘤医院治疗的431例乳腺癌化疗患者作为建模组,构建CIPN列线图模... 详细信息

目的探讨乳腺癌患者化疗致周围神经病变(chemotherapy-induced peripheral neuropathy,CIPN)的影响因素,建立预测CIPN的列线图模型。方法选择2019年7月至2022年1月福建省肿瘤医院治疗的431例乳腺癌化疗患者作为建模组,构建CIPN列线图模型;另选取89例乳腺癌患者作为验证组,比较两组患者的危险因素并绘制受试者工作特征曲线。结果多因素分析显示:年龄、糖尿病、体质量指数(body mass index,BMI)、化疗前焦虑、化疗次数是CIPN的独立危险因素(P<0.05);建模组和验证组的受试者工作特征曲线下面积分别为0.723(95%CI:0.676~0.770)和0.771(95%CI:0.676~0.866)。结论本研究构建的列线图模型对乳腺癌化疗致周围神经病变的诊断具有较好的精确度和区分度。

关键词：乳腺癌化疗致周围神经病变列线图

肌内效贴联合太极拳锻炼在乳腺癌患者术后康复中的应用价值

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中西医结合护理（中英文） 2022年第8期8卷 82-84页

作者：石灵芳徐雅惠洪珊梅陈金烟福建医科大学肿瘤临床医学院福建省肿瘤医院乳腺肿瘤内科福建福州350014

目的探讨肌内效贴联合太极拳锻炼在乳腺癌患者术后康复中的应用价值。方法选取2021年1~12月福建医科大学肿瘤临床医学院收治的96例乳腺癌患者为研究对象,将其按抽签法分为对照组和观察组,各48例。对照组患者给予康复功能训练,观察组患... 详细信息

目的探讨肌内效贴联合太极拳锻炼在乳腺癌患者术后康复中的应用价值。方法选取2021年1~12月福建医科大学肿瘤临床医学院收治的96例乳腺癌患者为研究对象,将其按抽签法分为对照组和观察组,各48例。对照组患者给予康复功能训练,观察组患者给予肌内效贴联合太极拳锻炼。比较2组患者的患侧上肢水肿发生情况、肩关节活动度、双侧上臂周径差值、上肢淋巴流量、生活质量和肩关节功能。结果观察组的患侧上肢水肿总发生率低于对照组(P<0.05)。干预3个月和6个月后,2组的外展、内收、后伸和前屈活动度均大于干预前(P均<0.05),且观察组均大于同期对照组(P均<0.05)。干预3个月和6个月后,2组的双侧上臂周径差值均小于干预前,上肢淋巴流量均比干预前更优(P均<0.05);观察组的双侧上臂周径差值和上肢淋巴流量均优于同期对照组(P均<0.05)。干预3个月和6个月后,2组的乳腺癌患者生命质量评价表和Constant-Murley肩关节功能评分均较干预前提高(P均<0.05),且观察组均比同期对照组更高(P均<0.05)。结论肌内效贴联合太极拳锻炼可降低乳腺癌患者术后患侧上肢水肿发生率,改善其生活质量、上肢淋巴流量、肩关节活动度和功能,减小双侧上臂周径差值。

关键词：乳腺癌肌内效贴太极拳水肿

Goldeneye^(TM)DNA身份鉴定系统22NC在福建汉族人群的遗传多态性和法医学应用价值

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福建医科大学学报 2022年第4期56卷 324-329页

作者：陈金烟韩俊永王坤金静君薛士杰福建省医学科学研究院免疫研究所福州350001 福建省医学科学研究院明正司法鉴定所福州350001

目的调查Goldeneye^(TM)DNA身份鉴定系统22NC所包含的21个常染色体短串联重复序列(STR)基因座在福建汉族人群中的遗传多态性,并对其法医学应用进行研究。方法应用该试剂盒对562例福建地区健康无关个体的21个常染色体STR基因座进行检测,... 详细信息

目的调查Goldeneye^(TM)DNA身份鉴定系统22NC所包含的21个常染色体短串联重复序列(STR)基因座在福建汉族人群中的遗传多态性,并对其法医学应用进行研究。方法应用该试剂盒对562例福建地区健康无关个体的21个常染色体STR基因座进行检测,计算等位基因频率、群体遗传多样性参数及连锁不平衡状况,并分析福建汉族人群与其他地区人群之间的基因频率分布差别情况。结果562例无关个体中,21个常染色体STR基因座共观察到229个等位基因,等位基因频率为0.0009~0.3754,具有较高的个体识别率和非父排除率,且均符合Hardy-Weinberg平衡,与其他地区人群部分基因频率分布差别有统计学意义(P<0.0024)。结论Goldeneye^(TM)DNA身份鉴定系统22NC在福建汉族人群中具有较高的遗传多态性,对群体遗传学研究有重要意义和法医学应用价值。

关键词：法医遗传学短串联重复序列 Goldeneye TM DNA身份鉴定系统22NC 汉族福建省

Luminex液相芯片检测系统性红斑狼疮患者外周血IFN-γ、IL-4和IL-17水平

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现代免疫学 2015年第4期35卷 311-315页

作者：马小美陈金烟余莲福建医科大学附属龙岩第一医院血液风湿科龙岩364000 福建省医学研究院福州350000

运用Luminex液相芯片检测SLE患者外周血IFN-γ、IL-4和IL-17水平变化与疾病的关系。选择82例SLE患者,其中30例SLE为初治患者,采用Luminex液相芯片检测82例SLE患者、30例初治患者治疗后三个月时血清中IFN-γ、IL-4和IL-17水平,通过横向研... 详细信息

运用Luminex液相芯片检测SLE患者外周血IFN-γ、IL-4和IL-17水平变化与疾病的关系。选择82例SLE患者,其中30例SLE为初治患者,采用Luminex液相芯片检测82例SLE患者、30例初治患者治疗后三个月时血清中IFN-γ、IL-4和IL-17水平,通过横向研究82例SLE患者其血清水平变化及与SLEDAI相关性,纵向研究30例SLE患者初治时、治疗后三个月时其血清水平变化及意义。结果显示,IL-17在SLE患者活动组显著高于稳定组、健康对照组,稳定组显著高于健康对照组(P<0.05),IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平在SLE患者活动组、稳定组、健康对照组三组之间差异无统计学意义;IL-17在SLE患者初治组、治疗后3个月组明显高于健康对照组,初治组明显高于SLE治疗后3个月组(P<0.05),IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平在SLE患者初治组、治疗后3个月组、健康对照组三组之间无统计学意义;IL-17与SLEDAI呈正相关,(r=0.338);IFN-γ与IL-17正相关性(r=0.364),血清IL-17水平在有肾脏损害的SLE患者中表达增高,差异具有显著的统计学意义(P<0.05)。研究表明,SLE患者外周血存在IFN-γ、IL-4、IL-17表达的失平衡,即CD4+T辅助细胞亚群失平衡,参与了疾病的发生过程和发展。

关键词：系统性红斑狼疮 T辅助细胞细胞因子

乙型肝炎病毒剪接蛋白在大肠埃希菌中的表达和纯化

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中国病原生物学杂志 2012年第5期7卷 321-324,328页

作者：吴龙飞陈金烟焦伯延郑大利林旭福建医科大学分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建福州350004

目的高效表达并获得高纯度的乙型肝炎病毒剪接蛋白(hepatitis B splicing protein,HBSP)。方法将HBSP编码基因克隆入原核表达载体pET43.1a(+),并在目的基因的C端引入StrepⅡ标签的编码序列,构建HBSP表达载体;将StrepⅡ标签的编码序列置... 详细信息

目的高效表达并获得高纯度的乙型肝炎病毒剪接蛋白(hepatitis B splicing protein,HBSP)。方法将HBSP编码基因克隆入原核表达载体pET43.1a(+),并在目的基因的C端引入StrepⅡ标签的编码序列,构建HBSP表达载体;将StrepⅡ标签的编码序列置于HBSP基因片段的N端,同时在StrepⅡ和HBSP之间引入终止密码子以构建对照载体。将以上质粒分别转化大肠埃希菌Rosetta(DE3),以IPTG诱导,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达及其可溶性;通过Strep-Tactin系统亲和层析纯化蛋白,Western blot检测其反应原性。结果成功构建HBSP重组表达载体pET-43-HBSP-StrepⅡ及对照载体pET-43-StrepⅡ,经IPTG诱导后,分别在大肠埃希菌中高表达Nus-HBSP-StrepⅡ及Nus-StrepⅡ融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶形式存在于细菌裂解上清液中。通过亲和层析获得纯度超过95%的Nus-HBSP-StrepⅡ及Nus-StrepⅡ融合蛋白,两融合蛋白均能被***Ⅱ单抗识别。结论在大肠埃希菌中可高效、可溶性表达并获得高纯度的HBSP融合蛋白及对照蛋白,为HBSP功能研究打下良好基础。

关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接大肠埃希菌基因表达

酵母双杂交筛选与单剪接型2．2kb乙型肝炎病毒剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第3期30卷 228-233页

作者：陈婉南陈金烟黄清玲林建银林旭福建医科大学分子医学研究中心福建省高校感染与肿瘤重点实验室福州350004

目的筛选与单剪接型2．2kb乙型肝炎病毒（HBV）剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白。方法PCR扩增单剪接型2．2kbHBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7，在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下，以酵母双杂交系统筛查与T... 详细信息

目的筛选与单剪接型2．2kb乙型肝炎病毒（HBV）剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白。方法PCR扩增单剪接型2．2kbHBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7，在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下，以酵母双杂交系统筛查与TPss蛋白相互作用的肝细胞蛋白，进而通过哺乳动物细胞双杂交实验验证候选肝细胞蛋白与TPss蛋白在Huh7和HepG2肝细胞中的相互作用。结果构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPss，Westernblot显示其在酵母中表达TPss蛋白。酵母双杂交筛选及哺乳动物细胞双杂交证实TPss蛋白可与4种肝细胞蛋白相互作用，即组织蛋白酶B、微粒体环氧化物水解酶、组织蛋白酶D与纤维蛋白原γ链。结论TPss可与多种肝细胞蛋白相互作用。

关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接酵母双杂交

Th17相关细胞因子在肌炎合并间质性肺病中的表达及临床意义

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免疫学杂志 2017年第10期33卷 891-895页

作者：余莲陈金烟马小美金静君袁跃兴福建医科大学附属龙岩第一医院血液与风湿科龙岩364000 福建省医学研究院福州350000

目的探讨多发性肌炎(polymyositis,PM)、皮肌炎(dermatomyositis,DM)合并间质性肺病(interstitial lung disease,ILD)患者血清Th17相关细胞因子白细胞介素(interleukin)17、白细胞介素(interleukin)22水平及临床意义。方法 50例PM/DM患者,分为ILD组和Non-ILD组,并与30例健康者对照研究。用Luminex液相芯片技术分别检测血清IL-17、IL-22水平,观察比较各组细胞因子表达情况。采用Mann-Whitney U检验进行统计结果分析。结果 (1)治疗前ILD组及Non-ILD组2组患者年龄、性别、CK、皮肤黏膜VAS评分、骨骼关节VAS评分、胃肠道VAS评分、心脏VAS评分、肌肉VAS评分的比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。(2)治疗前血清IL-17、IL-22在PM/DM组的表达高于健康对照组,差异有统计学意义(均P<0.01),且ILD组较Non-ILD组显著增高(均P<0.01)。(3)ILD组患者治疗后血清IL-17、IL-22水平较治疗前明显下降,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论 IL-17、IL-22可能参与了PM/DM的发病,同时在PM/DM-ILD发病过程中起重要作用;IL-17、IL-22高表达可作为PM/DM-ILD发病预测及疗效判定的重要参考指标。

关键词：间质性肺病多发性肌炎皮肌炎细胞因子液相芯片

造血干细胞移植后免疫重建早期T细胞受体删除环的检测分析

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中国组织工程研究 2018年第29期22卷 4643-4649页

作者：王坤韩俊永陈金烟刘慎敏薛士杰金静君福建省医学科学研究院免疫研究所福建省医学测试重点实验室福建省福州市350001

背景:目前对于造血干细胞移植后的免疫监测缺乏直接明确的检测指标,利用不断改良的实时定量荧光PCR技术监测T细胞受体删除环(T-cell receptor excision circle,TREC或signal joint T-cell receptor excision circle,sjTREC)拷贝数来反... 详细信息

背景:目前对于造血干细胞移植后的免疫监测缺乏直接明确的检测指标,利用不断改良的实时定量荧光PCR技术监测T细胞受体删除环(T-cell receptor excision circle,TREC或signal joint T-cell receptor excision circle,sjTREC)拷贝数来反映胸腺新近功能,从而评估免疫重建水平,指导预后治疗。目的:检测造血干细胞移植患者免疫重建早期T细胞受体删除环水平,分析移植方式、年龄、疾病类型、性别等因素的影响。方法:采用Taq Man探针,实时定量荧光PCR技术检测29例健康正常人,19例造血干细胞移植前患者,6例造血干细胞移植后患者的外周血1 000个细胞中所含sjTREC拷贝数。结果与结论:(1)正常对照组1 000个细胞中所含sjTREC拷贝数为26.99±29.3,随年龄增加而降低,男女性别sjTREC水平无明显差异;患者组移植前sjTREC水平低于正常对照组且差异有显著性意义(P=0.006);(2)6例患者移植后1个月时sj TREC水平上升,移植后6个月时sjTREC水平下降;(3)移植后6个月时2例HLA半相合亲缘移植与4例HLA全相合非亲缘移植患者sjTREC水平接近;(4)结果表明,移植前患者胸腺功能严重受损,在移植后1个月出现短暂上升后下降的趋势可能与胸腺应激性反应相关;亲缘与非亲缘移植、男性与女性、不同年龄患者等单因素分析未见明显差异,但移植后sjTREC水平上升反映了移植后胸腺新近输出功能的变化,体现了免疫重建受多种因素的影响。

关键词： T细胞受体删除环异基因造血干细胞移植免疫重建胸腺功能干细胞造血干细胞移植基因重排,T淋巴细胞胸腺组织工程