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人类副肠孤病毒检测方法的建立及全基因组序列特征的研究

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人类副肠孤病毒检测方法的建立及全基因组序列特征的研究

作者：路环环中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

研究目的:1.手足口样本的实验室诊断病例占临床诊断病例的比例较低,并且副肠孤病毒感染后的很多症状与手足口疾病症状相似,所以本研究对临床诊断手足口病例但是EV(-)的样本进行了 HPeV检测。2.尽管有证据表明HPeVs存在于各种严重的儿科... 详细信息

研究目的:1.手足口样本的实验室诊断病例占临床诊断病例的比例较低,并且副肠孤病毒感染后的很多症状与手足口疾病症状相似,所以本研究对临床诊断手足口病例但是EV(-)的样本进行了 HPeV检测。2.尽管有证据表明HPeVs存在于各种严重的儿科感染性疾病中,但是在国内缺乏针对副肠孤病毒的监测。本研究建立副肠孤病毒的检测方法,弥补对副肠孤病毒监测的不足,具有重要的公共卫生意义和实际应用价值。3.在中国,针对副肠孤病毒基因组特征的研究很少,所以本研究对2019年北京健康儿童粪便样本中检出的HPeV进行分子分型以及进化和重组规律的研究。实验方法:本实验建立了针对全部血清型HPeV的单管real-time RT-PCR检测方法,并对其敏感性、特异性和重复性进行了测试。利用2019年北京健康儿童的748份样本和2019年甘肃省1097份手足口病样本进行对该检测方法进行验证。设计针对VP1序列扩增的用于分子分型的引物序列,且利用高通量测序技术对阳性样本的全基因组序列进行测定,对VP1区域序列和全基因组序列进行进化重组分析。研究结果:1.建立了针对全部基因型HPeV的单管real-time RT-PCR检测方法,此检测方法只可特异性检测HPeV,最低检测下限(the limit of detection,LOD)为102拷贝数/μL,变异系数(CV)均小于1.5%。2.748份北京健康儿童粪便样本中,11份样本核酸检测阳性,均成功扩增出VP1区域,分子分型结果为8株HPeV-1,1株HPeV-4以及2株HPeV-6。3.利用HT-29,A549,Vero以及RD四种细胞系对核酸阳性样本进行病毒分离,其中2株(18.2%)在A549细胞上出现了细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),3 株(27.3%)在 Vero 细胞上出现了 CPE,有 8 株(72.7%)在HT-29细胞上出现了 CPE,RD细胞中未出现CPE现象。4.利用高通量测序技术对11份核酸阳性样本进行全基因组测序,获得7条全序,其中6条HPeV-1,1条HPeV-6,经重组分析发现6株HPeV-1具有三种不同的重组模式,HPeV-6未发现重组现象。5.对2019年甘肃省1097份手足口样本进行HPeV检测,结果发现核酸阳性率为4.19%,未能分离到HPeV,且高通量测序结果仅有1株样本的部分3D序列,结果初步显示HPeV与手足口病之间的关联性不大。研究结论:1.本实验建立的real-time RT-PCR检测方法具有良好的特异性,灵敏性和重复性。2.在2019年北京健康儿童中,HPeV感染所占比例最高的是1型,其次是6型,与世界范围内的流行情况一致。3.在本研究中对HPeV病毒分离最敏感的细胞系为HT-29,但值得注意的是HPeV-3不能在此细胞上得到有效复制。4.利用高通测序技术获得7株全序,6株为HPeV-1,1株为HPeV-6,6株HPeV-1存在三种不同的重组模式,广泛与HPeV-5和HPeV-7存在重组现象;1株HPeV-6未发现任何重组现象。5.针对HPeV与手足口病之间的关系的初步探索发现HPeV与手足口病之间的关联性不大。

关键词：人类副肠孤病毒方法学建立实时定量PCR 分子分型进化分析重组分析

2019~2020年我国大蒜市场分析与展望

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中国蔬菜 2020年第9期 9-12页

作者：任长华路环环李继峰陈明均中国蔬菜流通协会北京100801 济宁市特色农业研究院山东济宁272000

2019年我国大蒜价格整体振荡上行,新蒜上市后蒜价相对高位运行;2020年前期蒜价保持相对高位运行,新蒜收获前呈断崖式下跌。预测2020年下半年大蒜市场供应仍大于需求,蒜价或将在低于2019年同期的价位上稳定微幅震荡;出口需求稳中有增;蒜... 详细信息

2019年我国大蒜价格整体振荡上行,新蒜上市后蒜价相对高位运行;2020年前期蒜价保持相对高位运行,新蒜收获前呈断崖式下跌。预测2020年下半年大蒜市场供应仍大于需求,蒜价或将在低于2019年同期的价位上稳定微幅震荡;出口需求稳中有增;蒜片加工需求量增加,蒜头销售需求量下降。

关键词：出口需求大蒜价格分析与展望高位运行大蒜市场需求量

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2018年河南省肠道病毒环境监测结果分析

病毒学报 2021年第5期37卷 1112-1118页

作者：张明瑜杨建辉路环环肖金波张勇张璐路明霞张延炀河南省疾病预防控制中心郑州450016 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家脊灰实验室国家卫生健康委生物安全重点实验室国家卫生健康委医学病毒与病毒病重点实验室北京102206

通过对2018年河南省环境污水中肠道病毒(Enterovirus,EV)的持续监测,了解河南省环境污水中脊灰病毒(PV)和非脊灰肠道病毒(NPEV)的血清型分布及流行情况。选取了河南省东、西、南、北、中部的五个城市,对每个城市有10万~30万人共同使用... 详细信息

通过对2018年河南省环境污水中肠道病毒(Enterovirus,EV)的持续监测,了解河南省环境污水中脊灰病毒(PV)和非脊灰肠道病毒(NPEV)的血清型分布及流行情况。选取了河南省东、西、南、北、中部的五个城市,对每个城市有10万~30万人共同使用的下水管网的地区进行污水采样,每两个月采集1次,每次采集两份污水样品,采集持续1年,对污水样品进行浓缩,将浓缩液接种至RD细胞、L20B细胞和HEp-2细胞进行病毒分离。对病毒分离物进行VP1区核苷酸序列测定分析,采用最大似然法构建系统进化树对EV进行分子定型,并进行核苷酸相似性分析。共采集污水样品60份,分离到EV阳性毒株16株(26.67%),分别为8株CVB5、3株E7、3株E11、1株CVB5+E11混合株;1株PVⅢ;环境监测标本与急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis,AFP)病例标本,在济源市和周口市分离到的CVB5比例有一致性,郑州市和济源市分离到的E7比例有一致性;污水标本中阳性毒株的检出时间要早于AFP病例标本中同种毒株型别的检出时间1~3个月。来源于AFP病例监测和环境监测的CVB5之间的核苷酸相似性为94.7%~99.6%,来源于AFP病例监测和环境监测的E7之间的核苷酸相似性为92.5%~100.0%。来源于AFP病例监测和环境监测的CVB5属于同一个基因型,E7也是同一个基因型,甚至是同一个病毒传播链。河南省2018年建立了环境监测方法,是AFP病例监测的有益的补充,也可对人类肠道病毒病流行或暴发进行预测和预警。

关键词：肠道病毒(EV) 环境监测

手足口病相关柯萨奇病毒A组8型全基因组序列特征分析

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中华流行病学杂志 2021年第8期42卷 1487-1492页

作者：王东艳宋洋韩振志肖金波路环环严冬梅冀天娇杨倩祝双利许文波张勇中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所/国家脊髓灰质炎实验室/世界卫生组织西太平洋区脊髓灰质炎参比实验室/国家卫生健康委生物安全重点实验室/国家卫生健康委医学病毒与病毒病重点实验室北京102206

目的研究中国2013-2018年手足口病病例分离的柯萨奇病毒A组8型(CV-A8)全基因组序列特征及对全基因组各编码区进行遗传进化分析。方法对我国不同地区手足口病患者分离的11株CV-A8的全基因组序列,采用Sequencher 5.0、MEGA 7.0等软件对获... 详细信息

目的研究中国2013-2018年手足口病病例分离的柯萨奇病毒A组8型(CV-A8)全基因组序列特征及对全基因组各编码区进行遗传进化分析。方法对我国不同地区手足口病患者分离的11株CV-A8的全基因组序列,采用Sequencher 5.0、MEGA 7.0等软件对获取的全基因组序列进行比对和遗传进化分析。结果序列比对显示11株CV-A8基因组长度在7393-7400 bp之间,与原型株比较,在编码区无碱基插入或缺失,在非编码区存在个别碱基的插入或缺失。11株CV-A8毒株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为78.3%-98.6%和92.6%-99.7%;与CV-A8原型株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.3%-98.2%和92.6%-99.7%。对CV-A8的VP1区序列进行了系统发育分析,可将CV-A8分为5个基因型:A、B、C、D和E,本研究11株CV-A8分属于C(1株)、D(2株)、E(8株)3个基因型。11株CV-A8毒株全基因组序列核苷酸和氨基酸同源性分别为81.3%%-98.8%和95.9%-99.5%,P2区进化树图显示,本研究的8株E基因型CV-A8和CV-A4、CV-A14和CV-A16原型株进化距离最近,P3区进化树图显示,本研究8株E基因型CV-A8和CV-A5、CV-A16、CV-A14和CV-A4进化距离最近。结论本研究中11株CV-A8其衣壳区呈现基因多样性,非衣壳区呈现重组多样性,提示CV-A8正在经历变异动态变化;CV-A8有可能成为手足口病的重要病原体,因此需要进一步加强监测CV-A8。

关键词：手足口病柯萨奇病毒A组8型分子进化重组

柯萨奇病毒A组6型对利巴韦林耐药性的初步研究

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病毒学报 2023年第2期39卷 384-392页

作者：王蕊王聪聪李晓亮宋洋刘莹李冀琛肖金波路环环刘志军孙强张勇潍坊医学院潍坊261053 国家脊髓灰质炎实验室国家卫生健康委员会生物安全重点实验室国家卫生健康委员会医学病毒与病毒病重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206 山东第一医科大学济南250117

柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CVA6)已成为近年来国内导致手足口病的主要病原体。本研究挑选16株中国流行的不同基因亚型的CVA6,通过在RD细胞上的细胞活性实验和观察致细胞病变效应来检测利巴韦林对不同CVA6毒株的抑制率。结果... 详细信息

柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CVA6)已成为近年来国内导致手足口病的主要病原体。本研究挑选16株中国流行的不同基因亚型的CVA6,通过在RD细胞上的细胞活性实验和观察致细胞病变效应来检测利巴韦林对不同CVA6毒株的抑制率。结果表明药物浓度在0.8mmol/L和0.4mmol/L作用下对部分CVA6有明显的抑制作用(P<0.0001),在0.8mmol/L药物浓度下根据抑制率的高低,将抑制率大于80%的CVA6株(5株,占31.25%)以及低于10%的CVA6株(5株,占31.25%)分别定义为对利巴韦林敏感组和耐药组。为了探究CVA6耐药性与病毒致病力之间的关系,在利巴韦林敏感组与利巴韦林耐药组分别随机挑选两株CVA6进行ICR乳鼠感染实验。通过观察乳鼠生存率、临床评分和体重变化,结果显示利巴韦林耐药组CVA6致病力均比利巴韦林敏感组弱,表明利巴韦林耐药与致病力之间存在一定联系。最后使用MEGA软件对利巴韦林敏感组和耐药组CVA6进行3D区氨基酸序列比对分析,发现两组CVA6在3D区75位、308位、342位、346位氨基酸完全不同,提示利巴韦林耐药与3D区的基因多态性存在一定联系。本研究提示对利巴韦林耐药的CVA6广泛存在,属于目前优势流行D3a基因亚型,不仅为手足口病患者个体化治疗提供了重要依据,而且对CVA6感染相关疾病的防控具有重要意义。

关键词：柯萨奇病毒A组6型利巴韦林差异位点分析耐药性

2015~2018年柯萨奇病毒A组6型在黑龙江省的持续流行

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病毒学报 2020年第2期36卷 201-206页

作者：张曼陈淑红张勇宋洋许军孙巍杨明韩振志肖金波路环环许文波刘志军杨倩潍坊医学院潍坊261053 黑龙江省疾病预防控制中心哈尔滨150001 国家脊髓灰质炎实验室世界卫生组织西太平洋区脊髓灰质炎参比实验室国家卫生健康委员会生物安全重点实验室国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206 中国科学院生物安全大科学研究中心北京102206

手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)是一类常见的儿童传染病,自2009年以来,柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)已经成为引起HFMD流行持续循环的重要病原之一,是其他肠道病毒(Enterovirus,EV)中的优势病原,而黑龙江省CV-A6相关研究报道尚欠缺。本研究为了解2015~2018年黑龙江省HFMD流行概况和病原学组成,并分析该地区CV-A6的基因特征,收集2015~2018年黑龙江省HFMD疫情资料进行流行病学分析,并采集HFMD病例临床标本进行EV核酸检测。对分离出的EV毒株进行CV-A6的特异性荧光定量PCR法检测,对所有CV-A6阳性毒株进行全长VP1区扩增和核苷酸序列测定,并与GenBank上下载的CV-A6分型代表株构建系统进化树,以了解CV-A6的基因特征。流行病学结果显示,2015~2018年黑龙江省HFMD疫情平稳且2017年有所下降,无死亡病例。黑龙江省每年7月~8月为HFMD流行高峰,患病人群平均年龄为(4.39±3.74)岁,男女患病比例为1.44∶1。全省13个地市均收集到标本,哈尔滨市标本数最多,占36.77%。2015~2018年在黑龙江省共分离到69株CV-A6,与CV-A6原型株的核苷酸相似性为81.8%~83.9%,氨基酸相似性为94.0%~96.3%,均属D3基因亚型的D3a进化分支。尽管肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV-A71)和CV-A16为主要病原,但D3基因亚型的CV-A6也已成为引起黑龙江省HFMD流行的稳定型别之一,且有加强的趋势,因此应加强CV-A6疫情的监控和分析,为该地区HFMD防控及疫苗研制提供基础数据。

关键词：柯萨奇病毒A组6型(CV-A6) D3基因亚型手足口病(HFMD)

全球柯萨奇病毒A组6型VP1区进化与正向选择位点分析

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国际病毒学杂志 2023年第2期30卷 105-109页

作者：肖金波路环环宋洋王东艳严冬梅张勇中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、国家脊髓灰质炎实验室、国家卫生健康委员会生物安全重点实验室、国家卫生健康委员会医学病毒与病毒病重点实验室北京102206 中国科学院生物安全大科学中心武汉430000

目的基于柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus group A type 6,CV-A6)VP1编码区寻找与其流行强度增加有关的关键氨基酸位点。方法对GenBank数据库中全部CV-A6 VP1编码区核苷酸序列进行筛选,获得其中的1533条序列进行比对。使用RAxML软件构... 详细信息

目的基于柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus group A type 6,CV-A6)VP1编码区寻找与其流行强度增加有关的关键氨基酸位点。方法对GenBank数据库中全部CV-A6 VP1编码区核苷酸序列进行筛选,获得其中的1533条序列进行比对。使用RAxML软件构建最大似然树。使用Shannon Entropy在线分析工具计算序列的氨基酸置换熵值,并用Datamonkey在线分析平台通过MEME,SLAC和FUBAR三种方法来分析正向选择位点。结果目前全球流行的CV-A6以D3基因亚型为主。在VP1编码区存在三个高度可变的氨基酸位点,分别是VP1-5、VP1-30、VP1-137。三种方法均发现VP1-5、VP1-90、VP1-137三个位点在流行中受到过正向选择的作用。结论应继续加强对D3基因亚型CV-A6的监测,D3基因亚型的CV-A6在位于DE环中的VP1-137高度可变且受到了正向选择的作用,需要加以重视,并通过进一步研究来确定它与D3亚型广泛流行的关系。

关键词：柯萨奇病毒A组6型 D3基因亚型系统发育分析氨基酸置换熵值正向选择位点

2017~2018年河北省重症手足口病的主要致病病原体为柯萨奇病毒A组6型

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病毒学报 2020年第2期36卷 192-200页

作者：肖金波于秋丽张勇宋洋张曼路环环韩振志刘莹莹冀天娇严冬梅祝双利许文波李琦国家脊髓灰质炎实验室世界卫生组织西太平洋区脊髓灰质炎参比实验室国家卫生健康委员会生物安全重点实验室国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206 中国科学院生物安全大科学研究中心武汉430000 河北省疾病预防控制中心石家庄050000

肠道病毒是引起重症手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)的主要病原体,近年来引起重症手足口病的病原谱正在发生变化,这为病原谱的检测带来了困难,而包括高通量测序(High-throughput sequencing,HTS)在内的新技术为明确重症手... 详细信息

肠道病毒是引起重症手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)的主要病原体,近年来引起重症手足口病的病原谱正在发生变化,这为病原谱的检测带来了困难,而包括高通量测序(High-throughput sequencing,HTS)在内的新技术为明确重症手足口病的病原谱提供了帮助。为了明确河北省2017~2018年重症手足口病的病原谱,本研究采集2017~2018年河北省重症HFMD病例的50份标本(2017年29份,2018年21份)进行病毒分离,从23份标本中分离到病毒,采用一代测序方法获得其全长VP1区序列,而其余27份标本未能直接分离到病毒,其中17份采用高通量测序的方法获得了部分或者全长基因组序列。序列分析结果显示,近年来河北省重症HFMD的肠道病毒病原谱发生了较大变化,2017年重症HFMD标本中,10份检出肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV-A71),1份检出柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16),10份检出柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)(其中高通量测序检出5份),还有3份检出其他肠道病毒;2018年重症HFMD标本中,1份检出CV-A16,7份CV-A6通过高通量测序检出,5份检出柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)(其中高通量测序检出3份),还有3份检出其他肠道病毒。通过高通量测序,可检出病原体的重症标本由原来的23份上升到40份,可检出CV-A6的标本由5份上升到17份,CV-A10由2份上升到5份;重症病例病原谱中CV-A6所占的比例由21.7%(5/23)上升到42.5%(17/40),CV-A10由8.7%(2/23)上升到12.5%(5/40),而EV-A71由于病毒分离比较敏感,含有EV-A71的标本病毒分离全部是阳性,高通量测序并没有多检出,在病原谱中的比例由43.5%(10/23)下降到25.0%(10/40)。RAxML构建的CV-A6和CV-A10的VP1区的系统发育树显示,CV-A6属于中国流行的优势基因亚型D3a,CV-A10属于中国流行的优势基因型C。河北重症HFMD标本检测到的两株CV-A6与其余中国CV-A6序列的3D区的核苷酸相似度为76.4%~98.9%,氨基酸相似度为92.7%~99.7%,两株CV-A10与其余中国CVA10序列的3D区的核苷酸相似度为93.2%~97.1%,氨基酸相似度为97.4%~99.7%。本研究揭示,引起河北重症HFMD的CV-A6和CV-A10均是中国目前流行的优势基因型,与中国流行株相比,并未发生新的重组事件。CVA6和CV-A10在引起河北重症HFMD的病原谱中所占比例逐渐增高,CV-A6超过EV-A71,已成为引起HFMD重症病例的优势型别,提示应该加强对CV-A6和CV-A10的监测,积极研制这两种病毒的疫苗,这将有助于进一步减少重症HFMD病例数,并减轻重症HFMD疾病负担。

关键词：重症手足口病(HFMD) 高通量测序(HTS) 病原谱柯萨奇病毒A组6型(CV-A6) 柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)

我国四株埃可病毒6型全基因组序列及重组特征分析

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病毒学报 2021年第1期37卷 123-132页

作者：程文隽蔡茹冀天娇陈雨马江涛单军于秋丽张勇严冬梅杨倩宋洋路环环张珂艺许文波安徽理工大学医学院淮南232001 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所脊髓灰质炎室世界卫生组织西太平洋区脊髓灰质炎参比实验室国家卫生健康委员会医学病毒与病毒病重点实验室北京102206 湖南省疾病预防控制中心长沙410005 宁夏疾病预防控制中心银川750004 江苏疾病预防控制中心南京210000 河北疾病预防控制中心石家庄050000

埃可病毒6型(Echovirus 6,ECHO6)作为肠道病毒B组(Enterovirus B,EV-B)的一员,在临床上常导致无菌性脑膜炎(Aseptic meningitis,AM)、急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis,AFP)、手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)等多种疾病。本文挑选四株中国大陆地区不同年份、地区及疾病严重程度的代表毒株进行全基因组测定分析,与GenBank上ECHO6全长代表株及EV-B组原型株比对分析,了解其进化特征,并筛选BLAST结果的EV-B组流行株,探究我国流行的ECHO6与其他血清型的基因重组特征。结果提示,本研究四株ECHO6毒株在非结构蛋白区与EV-B其他血清型均发生重组,其中死亡病例标本重组模式更为复杂,可能与疾病严重程度有关。通过本研究分析,可进一步揭示ECHO6的遗传特征,为肠道病毒血清型研究提供基础数据,对了解其进化变异及临床致病力影响具有重要意义。

关键词：埃可病毒6型(ECHO6) 全基因组序列基因重组