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睫状神经营养因子突变体的克隆、表达、纯化及生物学活性

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中国生物制品学杂志 2007年第5期20卷 313-317页

作者：毕华袁力勇史新昌李永红赵阳饶春明王军志中国药品生物制品检定所生化室北京100050

目的设计具有更高生物学活性的睫状神经营养因子突变体,并对其进行表达、纯化及生物学活性检测。方法以计算机分子模拟系统设计突变体,重叠延伸PCR方法获得突变体的编码区DNA序列,克隆入表达载体pThioHisA,转化***21,以IPTG诱导表达。... 详细信息

目的设计具有更高生物学活性的睫状神经营养因子突变体,并对其进行表达、纯化及生物学活性检测。方法以计算机分子模拟系统设计突变体,重叠延伸PCR方法获得突变体的编码区DNA序列,克隆入表达载体pThioHisA,转化***21,以IPTG诱导表达。复性纯化后,用鸡胚背根神经节无血清培养法和小鼠减重法进行生物学活性测定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,表达量在35%以上,纯化后的纯度达95%以上,能有效地促进鸡胚背根神经节的生长,并能使正常小鼠的体重降低,脂肪指数下降。结论所设计的突变体经表达及纯化后,具有良好的生物学活性,为进一步研究突变体蛋白的促神经生长和减肥作用奠定了基础。

关键词：睫状神经营养因子突变体克隆表达生物学活性

重组hPK-5质粒DNA基因治疗制剂的质量标准研究

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药物分析杂志 2008年第5期28卷 661-666页

作者：李永红张勇朝袁力勇史新昌饶春明王军志中国药品生物制品检定所北京100050

目的:建立重组 hPK-5质粒 DNA 基因治疗制剂的质量标准和检测方法。方法:采用限制性酶切图谱分析鉴定质粒DNA 结构和 PCR 法鉴定插入的 hPK-5基因作鉴别试验;采用分光光度法测定质粒 DNA 含量和 A_(260)/A_(280)比值;采用琼脂糖凝胶电... 详细信息

目的:建立重组 hPK-5质粒 DNA 基因治疗制剂的质量标准和检测方法。方法:采用限制性酶切图谱分析鉴定质粒DNA 结构和 PCR 法鉴定插入的 hPK-5基因作鉴别试验;采用分光光度法测定质粒 DNA 含量和 A_(260)/A_(280)比值;采用琼脂糖凝胶电泳法分析质粒 DNA 的超螺旋构象比例和残留 RNA 含量;采用阴离子交换色谱法分析 HPLC 纯度;采用 ELISA 法测定hPK～5蛋白的表达量;采用内皮细胞迁移法测定 hPK-5蛋白的生物学活性。结果:重组质粒 DNA 的限制性酶切片段大小与理论值一致;插入基因 PCR 扩增片段大小与理论值相符;质粒 DNA 含量为1.12 mg·mL^(-1);A_(260)/A_(280)比值为1.83;琼脂糖凝胶电泳法测定超螺旋构象质粒的比例为95.4%;HPLC 测定超螺旋质粒 DNA 占93.8%,开环质粒 DNA 占6.2%,琼脂糖凝胶电泳法测定木检出 RNA 残留;没有检出其他杂质;以2μg重组 hPK-5质粒转染5×10~5Hela 细胞48 h 后,2 mL 培养上清中 hPK-5蛋白浓度为109 ng·mL^(-1);以培养上清进行内皮细胞迁移试验,转染重组 hPK-5质粒 DNA 组迁移的内皮细胞数明显少于对照绀(P<0.05)。其他项目均符合相应的规定。结论:建立了重组 hPK-5质粒 DNA 基因治疗制剂的检定方法及其质量标准,为有效控制该类产品的质量打下基础。

关键词： hPK-5 质粒DNA载体质量控制基因治疗

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水痘减毒活疫苗临床病例病原学分析

中国生物制品学杂志 2023年第5期36卷 589-593页

作者：权娅茹袁力勇陈震邱平李长贵中国食品药品检定研究院呼吸道病毒疫苗室北京102629

目的对水痘减毒活疫苗临床病例进行病原学分析。方法采集企业水痘减毒活疫苗Ⅲ期临床试验(试验地点为河南省)中临床确诊为水痘病例的49名患者身上的水痘疱疹液,共64份,提取DNA,采用PCR和限制性片段多态性(PCR and restriction fragment ... 详细信息

目的对水痘减毒活疫苗临床病例进行病原学分析。方法采集企业水痘减毒活疫苗Ⅲ期临床试验(试验地点为河南省)中临床确诊为水痘病例的49名患者身上的水痘疱疹液,共64份,提取DNA,采用PCR和限制性片段多态性(PCR and restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)法区分野毒株和疫苗株;采用2008年国际水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)基因型命名专题会议上建议的基因分型法进行基因型分析。结果64份疱疹液均为野毒型(PstⅠ^(+)SmaⅠ^(-)BssHⅡ^(-)NaeⅠ^(-)),无疫苗相关病例发生。49份疱疹液均为Clade 2遗传支;与Clade 2遗传支相比,49份疱疹液水痘病毒基因均在SNP18082位点发生了T→C同义突变,1份在790位点发生了C→A突变。结论在河南省开展的水痘减毒活疫苗临床试验中的临床病例均为野毒株感染引起,属Clade 2遗传支。

关键词：水痘带状疱疹病毒野毒株疫苗株基因分型

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利用DNA免疫技术制备麻疹病毒抗血清

中国生物制品学杂志 2016年第9期29卷 984-986页

作者：权娅茹崔晓雨易敏徐涵陈震邱平李长贵袁力勇中国食品药品检定研究院北京100050 苏州杰恩生物技术有限公司江苏苏州215123

目的利用DNA免疫技术制备特异性麻疹病毒抗血清,用于麻疹减毒活疫苗毒种以及含麻疹病毒疫苗的检定。方法以含麻疹病毒沪-191融合蛋白F和血凝素H基因的重组真核表达载体pGI-F和pGI-H作为免疫原,免疫家兔,制备麻疹病毒抗血清。采用细胞培... 详细信息

目的利用DNA免疫技术制备特异性麻疹病毒抗血清,用于麻疹减毒活疫苗毒种以及含麻疹病毒疫苗的检定。方法以含麻疹病毒沪-191融合蛋白F和血凝素H基因的重组真核表达载体pGI-F和pGI-H作为免疫原,免疫家兔,制备麻疹病毒抗血清。采用细胞培养法检测抗血清细胞毒性,ELISA法检测抗体滴度,微量细胞病变法检测抗血清的特异性和中和效价。结果麻疹病毒抗血清细胞毒性小,与风疹病毒、腮腺炎病毒、水痘病毒均无交叉反应。抗血清的ELISA效价大于256 000,中和效价为1∶1 024,4倍稀释后仍能完全中和1×10 5 CCID50/ml麻疹病毒。结论 DNA免疫方法可制备高效价、低细胞毒性的麻疹病毒抗血清,该血清可用于麻疹疫苗毒种及含麻疹疫苗的质量控制。

关键词： DNA免疫家兔麻疹病毒抗血清中和效价

2006～2009年流感疫苗批签发情况总结与质量分析

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中国生物制品学杂志 2011年第9期24卷 1118-1120页

作者：刘书珍邵铭邱平袁力勇方捍华李长贵中国食品药品检定研究院病毒三室北京100050

流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道感染疾病,具有传染性强、传播速度快的特点。据报道,全球每年约有5%～15%的人口会感染流感病毒,并导致300万～500万的严重病例和50万的死亡病例。接种流感疫苗是预防流感发生与传播... 详细信息

流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道感染疾病,具有传染性强、传播速度快的特点。据报道,全球每年约有5%～15%的人口会感染流感病毒,并导致300万～500万的严重病例和50万的死亡病例。接种流感疫苗是预防流感发生与传播的有效手段。

关键词：流感疫苗批签发血凝素质量分析

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腮腺炎减毒活疫苗国家参考品的制备及标定

中国新药杂志 2014年第20期23卷 2450-2452页

作者：李红李娟袁力勇易敏权娅茹李长贵中国食品药品检定研究院北京100050

目的：制备腮腺炎减毒活疫苗国家参考品,并进行标定。方法：选用国内腮腺炎疫苗生产毒株S79制备腮腺炎疫苗参考品。在生产过程中严格控制精密性、水分含量,对候选参考品进行鉴别试验、病毒滴度、水分含量、牛血清蛋白残留量及无菌检查... 详细信息

目的：制备腮腺炎减毒活疫苗国家参考品,并进行标定。方法：选用国内腮腺炎疫苗生产毒株S79制备腮腺炎疫苗参考品。在生产过程中严格控制精密性、水分含量,对候选参考品进行鉴别试验、病毒滴度、水分含量、牛血清蛋白残留量及无菌检查等试验。检验合格后组织4个实验室对候选参考品病毒滴度进行协作标定,计算实验室内变异及实验室间变异系数;对候选国家参考品进行稳定分析。结果：制备的候选参考品鉴别试验、无菌检查结果均符合规定,水分含量为1.6%。经协作标定,腮腺炎减毒活疫苗病毒滴定候选国家参考品的病毒滴度为（4.96±0.38）lgCCID50·mL^-1,实验室内变异系数在2.0%-4.1%之间;稳定性考核数据显示制备的参考品具有较好的稳定性。结论：制备的参考品符合作为腮腺炎减毒活疫苗国家参考品的要求。

关键词：腮腺炎减毒活疫苗国家参考品协作标定

人纤溶酶原K5基因在毕赤酵母中的表达及其抗肿瘤活性

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中国生物制品学杂志 2008年第7期21卷 560-564页

作者：袁力勇刘勇饶春明马雁冰史新昌王军志戴长柏中国药品生物制品检定所北京100050 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心北京100050 中国医学科学院医学生物学研究所昆明650117

目的在毕赤酵母中表达人纤溶酶原K5基因,并检测hK5蛋白的抗肿瘤活性。方法根据酵母遗传密码的偏爱性优化设计hK5基因,构建重组表达质粒p819-8α-hK5,经G418加压筛选和甲醇诱导表达,并对摇瓶发酵条件进行优化。表达的hK5蛋白经纯化后,通... 详细信息

目的在毕赤酵母中表达人纤溶酶原K5基因,并检测hK5蛋白的抗肿瘤活性。方法根据酵母遗传密码的偏爱性优化设计hK5基因,构建重组表达质粒p819-8α-hK5,经G418加压筛选和甲醇诱导表达,并对摇瓶发酵条件进行优化。表达的hK5蛋白经纯化后,通过荷H22肿瘤昆明小鼠模型检测其抗肿瘤活性。结果筛选到2株高表达hK5蛋白的转化子,摇瓶表达量超过150mg/L,纯化后的蛋白纯度大于95.0%,并能够显著抑制昆明小鼠H22肿瘤的生长。结论hK5基因能够在毕赤酵母中高效分泌表达,且表达的hK5蛋白具有良好的抗肿瘤活性。

关键词：人纤溶酶原 K5基因毕赤酵母表达抗肿瘤活性

剖宫产时蛛网膜下隙0.75%罗哌卡因麻醉的ED_(50)

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中国临床药理学与治疗学 2008年第8期13卷 905-908页

作者：沈晓署甘果袁力勇宁波市妇女儿童医院麻醉科

目的：确定剖宫产时蛛网膜下隙0.75%罗哌卡因（ropivacaine,Rop）麻醉的半数有效剂量（ED50）。方法：32名ASAⅠ-Ⅱ、择期在蛛网膜下隙-硬膜外隙联合麻醉（combined spinal-epidural an-esthesia,CSEA）下剖宫产产妇参加试验。第一位产... 详细信息

目的：确定剖宫产时蛛网膜下隙0.75%罗哌卡因（ropivacaine,Rop）麻醉的半数有效剂量（ED50）。方法：32名ASAⅠ-Ⅱ、择期在蛛网膜下隙-硬膜外隙联合麻醉（combined spinal-epidural an-esthesia,CSEA）下剖宫产产妇参加试验。第一位产妇0.75%Rop剂量为12.8mg,以相邻剂量的98.4%为剂量的变化幅度。感觉、运动神经阻滞分别以针刺法及改良Bromage法测定。麻醉有效的指标为：蛛网膜下隙给药后10min内感觉平面阻滞达到T7、Bromage达3分、切皮不痛、肌松满意。计算剖宫产时蛛网膜下隙0.75%Rop麻醉的ED50及其95%可信区间（CI）。结果：32名产妇中有5例麻醉效果可疑,剔除出本研究。根据其余27名产妇序贯试验得出剖宫产时蛛网膜下隙0.75%Rop麻醉的ED50为11.97mg,ED50的95%CI为11.75-12.19mg。结论：L3-4间隙CSEA下剖宫产时,蛛网膜下隙0.75%罗哌卡因麻醉的ED50为11.97mg。

关键词：剖宫产蛛网膜下隙-硬膜外隙联合麻醉罗哌卡因半数有效剂量

甲型流感病毒NP含量ELISA检测方法的建立

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药物分析杂志 2015年第9期35卷 1556-1561页

作者：权娅茹崔晓雨邵铭刘书珍易敏李长贵王军志袁力勇中国食品药品检定研究院北京100050

目的：建立一种双抗体夹心ELISA检测方法,以检测流感疫苗中甲型流感病毒的核蛋白（NP）含量。方法：体外重组表达NP作为ELISA法测定蛋白含量参考品,筛选捕获抗体和检测抗体工作浓度、起始浓度和系列稀释倍数,建立ELISA法并对其进行优化... 详细信息

目的：建立一种双抗体夹心ELISA检测方法,以检测流感疫苗中甲型流感病毒的核蛋白（NP）含量。方法：体外重组表达NP作为ELISA法测定蛋白含量参考品,筛选捕获抗体和检测抗体工作浓度、起始浓度和系列稀释倍数,建立ELISA法并对其进行优化和验证。结果：获得的重组NP纯度为99.0%以上。建立和优化后的ELISA参数：捕获抗体4μg·m L^-1,检测抗体1∶1 000。NP含量参考品起始浓度为300~600 ng·m L^-1,四参数拟合S型曲线的决定系数R^2大于0.95,对疫苗中的甲型流感病毒NP具有特异性,原液和成品的加标回收率为88.2%~95.3%,方法重复性（n=5）的RSD小于15%。结论：建立的流感疫苗中甲型流感病毒NP含量ELISA检测方法特异性好,准确性和精密性高,可用于疫苗样品中甲型流感病毒NP含量的检测。

关键词：甲型流感病毒核蛋白(NP) 重组NP 酶联免疫吸附测定(ELISA) 捕获抗体检测抗体