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红色红曲霉T-DNA插入突变库的构建及GABA代谢相关基因的克隆

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红色红曲霉T-DNA插入突变库的构建及GABA代谢相关基因的克隆

作者：蔡琪敏浙江师范大学

学位级别：硕士

红曲霉(Monascus)作为我国重要的微生物资源,已经有着上千年的应用历史。其在生长过程中能产生红曲色素、γ-氨基丁酸(y-Aminobutyric Acid, GABA)、MonacolinK、固醇、异黄酮、不饱和脂肪酸、蛋白酶等多种生理活性物质。GABA作为红曲... 详细信息

红曲霉(Monascus)作为我国重要的微生物资源,已经有着上千年的应用历史。其在生长过程中能产生红曲色素、γ-氨基丁酸(y-Aminobutyric Acid, GABA)、MonacolinK、固醇、异黄酮、不饱和脂肪酸、蛋白酶等多种生理活性物质。GABA作为红曲霉多种代谢产物之一,具有抵抗焦虑、降低血压、改善脑部机能、促进生长激素分泌、活化肝功能、肾功能等作用,已经发展成为一种新型的功能性因子。几年前,红曲霉的研究主要集中在菌种分类选育、活性成分分离纯化及发酵工艺条件优化等方面,近年来,分子生物学的研究也逐渐起步,但很多尚处于探索和建立方法的阶段,对红曲霉的遗传背景知识了解很少,对GABA代谢相关基因的研究工作更是鲜见报道。本研究以实验室保存的红色红曲霉(Monascus ruber)菌种Mr-5为实验材料,建立了根癌农杆菌介导红色红曲霉的高效转化体系,通过形态观察及显微特征分析,筛选获得了一批形态特征变化明显的转化子,并初步研究了其主要代谢产物。在此基础上,采用TAIL-PCR技术扩增了部分转化子T-DNA插入位点的侧翼序列。主要研究结果如下：1、根癌农杆菌介导的红色红曲霉T-DNA插入突变体库的构建利用根癌农杆菌介导的转化技术,通过对根癌农杆菌浓度、红色红曲霉培养时间、红色红曲霉分生孢子液浓度、诱导剂乙酰丁香酮(AS)浓度、根癌农杆菌与红色红曲霉的共培养温度、共培养时间、共培养膜类型等转化因素的优化,建立了根癌农杆菌介导红色红曲霉的高效转化体系：红色红曲霉在PDA培养基上培养21d后收集孢子,制备红色红曲霉孢子悬浮液,浓度为106孢子/mL,根癌农杆菌浓度OD600为0.5,诱导剂AS浓度为100μmol/L,根癌农杆菌与红色红曲霉在硝酸纤维素膜(NC膜)上25℃共培养3d。采用此体系成功构建了含有1300多个红色红曲霉转化子的T-DNA插入突变体库。2、转化子的遗传稳定性分析、PCR鉴定及形态观察将1300多株红色红曲霉转化子接种于PDA培养基,随机挑选50株转化子接种到不含潮霉素B的PDA培养基上,30℃培养7d。连续转接6次后,再转接到含200μg/mL潮霉素B的PDA培养基上,同时接种出发菌株Mr-5作为对照,30℃培养,观察菌落生长情况,计算其稳定性。同时提取基因组DNA进行潮霉素抗性基因PCR鉴定。结果显示,上述转化子的遗传稳定性高达98%,并且转化子菌株的基因组中均有T-DNA插入。将1300多株红色红曲霉转化子菌株接种到PDA培养基上,30℃培养7d,进行菌落形态及显微形态观察。结果表明,大部分转化子与原始菌株差别不大,只有少数转化子在菌落颜色、菌落隆起、生长速度、气生菌丝、菌丝表面附着物、分生孢子形状、闭囊壳数量及形态等方面发生了较大变化。3、转化子的主要代谢产物分析采用纸层析、UV-VIS、TLC等方法测定了突变体库中红色红曲霉转化子的GABA、色价和桔霉素含量,结果显示,与原始菌株相比,转化子菌株产代谢产物的能力发生了不同程度的变化。GABA方面,14株代表性转化子菌株中有13株的GABA产量有明显高于原始菌株Mr-5,其中Mr-5-50的产量达到3.161g／L,约为Mr-5的4.37倍;色价方面,4株转化子菌株在505nm处的色价明显升高,其中Mr-5-155高达106.5U／mL,是Mr-5色价33.27U／mL的3.2倍;2株转化子菌株的色价明显降低,其中Mr-5-33菌株的色价仅为7.48U／mL,只有Mr-5的0.22倍。同时,部分转化子菌株在300-600nm的吸收波长也发生了不同程度的变化,如Mr-5-7、Mr-5-35、Mr-5-38、Mr-5-54、Mr-5-59、 Mr-5-97、Mr-5-155均有三个吸收峰,Mr-5-46和Mr-5-50均只有390-400nm左右的一个吸收峰,Mr-5-158吸收峰不明显,而原始菌株Mr-5有两个吸收峰。桔霉素方面,5株转化子菌株发酵液中的桔霉素含量有所降低,其中Mr-5-50的桔霉素含量未检测出,可能低于TLC方法能够检测的最低值0.2μg／g。4、转化子侧翼序列扩增及生物信息学分析采用TAIL-PCR技术对14株红色红曲霉GABA转化子菌株T-DNA插入位点的右臂侧翼序列进行了扩增,成功获得了转化子Mr-5-72的T-DNA右侧序列,命名为gabaX-72,大小为405bp,对其氨基酸序列进行了同源性搜索,发现其与构巢曲霉(Aspergillus nidulans) FGSCA4的假定蛋白AN7090.2有98%相似性。综合研究发现,Mr-5-72在气生菌丝形态、分生孢子产生能力、菌落生长速度、红曲色素和桔霉素产量等方面都与原始菌株Mr-5差别不大,但

关键词：红色红曲霉根癌农杆菌 GABA ATMT TAIL-PCR

FTIR结合生理特性研究镉胁迫对果灰藓的影响

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光谱学与光谱分析 2009年第3期29卷 620-623页

作者：顾艳红刘鹏蔡琪敏陈洁谢鸿锴浙江师范大学植物学实验室浙江金华321004

苔藓植物可作为监测环境中重金属污染的指示植物。以苔藓植物果灰藓为实验材料,用不同浓度的重金属镉处理7 d后,借助傅里叶红外光谱法(FTIR)分析重金属镉胁迫下果灰藓各化学成分的变化,同时测定可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(Pr)、丙二醛(M... 详细信息

苔藓植物可作为监测环境中重金属污染的指示植物。以苔藓植物果灰藓为实验材料,用不同浓度的重金属镉处理7 d后,借助傅里叶红外光谱法(FTIR)分析重金属镉胁迫下果灰藓各化学成分的变化,同时测定可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(Pr)、丙二醛(MDA)含量在镉胁迫下的生理指标。结果表明:随着镉处理浓度的升高,可溶性糖含量和可溶性蛋白含量呈现先上升后下降的趋势,丙二醛含量先下降后上升。FTIR与果灰藓响应重金属镉胁迫的各生理指标变化趋势较一致,且FTIR比传统的生理指标测定更敏感、便捷。因此,FTIR可以作为研究苔藓植物应用于环境重金属污染监测的一种快速、有效的方法。

关键词：红外光谱生理指标果灰藓镉胁迫环境监测

高中数学课堂教学理念：生活化、课本习题化、习题课本化

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亚太教育 2022年第16期 127-129页

作者：张洋蔡琪敏上海师范大学

课堂教学是教学活动中最重要的一个环节，教师的教学任务、教学目标的完成主要通过课堂教学来实现，学生获取知识的主要阵地也是课堂。课堂教学的好坏，直接影响教师的教学进度、质量以及学生汲取新知的效率，因此选取什么样的教学理念... 详细信息

课堂教学是教学活动中最重要的一个环节，教师的教学任务、教学目标的完成主要通过课堂教学来实现，学生获取知识的主要阵地也是课堂。课堂教学的好坏，直接影响教师的教学进度、质量以及学生汲取新知的效率，因此选取什么样的教学理念进行课堂教学是至关重要的。基于此，探讨了将生活化、课本习题化、习题课本化教学理念融入高中数学课堂教学中的必要性、重要意义以及实现策略。

关键词：高中数学课堂教学生活化课本习题化习题课本化

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响应面法优化红曲霉胞外多糖提取工艺

中国粮油学报 2011年第12期26卷 83-87,92页

作者：汪鹏荣蔡琪敏崔宇辉蒋冬花陈丹凤浙江师范大学化学与生命科学学院金华321004

对实验室自行分离得到的紫色红曲霉MP-66发酵液中的胞外多糖提取条件进行优化,以提高胞外多糖的产量。通过单因素试验,研究了乙醇体积分数、乙醇沉淀时间、发酵滤液pH对红曲霉胞外多糖的得率的影响,并在单因素试验基础上,设计三因素三... 详细信息

对实验室自行分离得到的紫色红曲霉MP-66发酵液中的胞外多糖提取条件进行优化,以提高胞外多糖的产量。通过单因素试验,研究了乙醇体积分数、乙醇沉淀时间、发酵滤液pH对红曲霉胞外多糖的得率的影响,并在单因素试验基础上,设计三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验及响应面法分析对红曲霉胞外多糖的提取工艺进行优化,建立了二次多项式回归方程的预测模型,结果表明:乙醇沉淀时间为16.5 h,乙醇体积分数为80%,发酵滤液pH为8.05,在此条件下红曲霉胞外多糖得率可达7.40 g/L。

关键词：胞外多糖提取工艺单因素试验响应面分析法

D001阳离子交换树脂分离红曲霉发酵液中γ-氨基丁酸的研究

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中国粮油学报 2011年第8期26卷 95-99页

作者：嵇豪蒋冬花周琴汪鹏荣董夏梦蔡琪敏浙江师范大学化学与生命科学学院金华321004

研究了红曲霉发酵液中的γ-氨基丁酸(GABA)分离纯化工艺。对3种脱色剂进行筛选,D101树脂对红曲发酵液具有最高的脱色率和GABA得率。分别以静态和动态吸附-解析方法考察D001离子交换树脂对GABA的最优分离条件,结果表明:脱色发酵液pH下上... 详细信息

研究了红曲霉发酵液中的γ-氨基丁酸(GABA)分离纯化工艺。对3种脱色剂进行筛选,D101树脂对红曲发酵液具有最高的脱色率和GABA得率。分别以静态和动态吸附-解析方法考察D001离子交换树脂对GABA的最优分离条件,结果表明:脱色发酵液pH下上样,上样流速为1 BV/h,采用水和2 mol/L氨水两步洗脱,洗脱液浓缩后结晶为透明针状,GABA的总得率为45.4%。

关键词： γ-氨基丁酸红曲霉发酵液 D001阳离子树脂分离

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铜胁迫对两种苔藓植物生理生化的影响

浙江林业科技 2008年第6期28卷 24-27页

作者：蔡琪敏陈洁张志祥顾艳红刘鹏浙江师范大学植物学实验室浙江金华321004 浙江师范大学生态研究所浙江金华321004

以果灰藓和丛本藓为材料,采用室内模拟培养、生理生化测定等实验手段,研究了铜胁迫对这两种苔藓植物生理生化特性的影响。结果表明,在Cu2+的作用下,果灰藓和丛本藓体内与逆境密切相关的物质和保护酶发生一系列的变化,且表现出明显的剂... 详细信息

以果灰藓和丛本藓为材料,采用室内模拟培养、生理生化测定等实验手段,研究了铜胁迫对这两种苔藓植物生理生化特性的影响。结果表明,在Cu2+的作用下,果灰藓和丛本藓体内与逆境密切相关的物质和保护酶发生一系列的变化,且表现出明显的剂量效应关系和时间效应关系。随着处理浓度的加大和处理时间的延长,叶绿素含量和过氧化物酶活性呈现先上升后下降的趋势;游离脯氨酸含量和丙二醛含量呈现逐渐升高的趋势。对比两种苔藓植物发现,果灰藓体内生理指标的变化较丛本藓的明显,说明果灰藓对铜胁迫反应较敏感,有利于监测重金属铜污染。

关键词：铜胁迫苔藓植物生理生化指标

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一株高产灵菌红素粘质沙雷氏菌的筛选与鉴定

浙江师范大学学报（自然科学版） 2011年第3期34卷 339-344页

作者：韦凤蒋冬花蔡琪敏宋迤明浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004

通过筛选自然生境中的产色素菌株,从淡水鱼体中分离得到一株高产红色色素的Sm-128菌株.经形态观察、生理生化实验和16S rDNA基因序列分析,鉴定Sm-128菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens).结合紫外吸收光谱及薄层色谱分析,证实Sm-12... 详细信息

通过筛选自然生境中的产色素菌株,从淡水鱼体中分离得到一株高产红色色素的Sm-128菌株.经形态观察、生理生化实验和16S rDNA基因序列分析,鉴定Sm-128菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens).结合紫外吸收光谱及薄层色谱分析,证实Sm-128菌株所产色素为灵菌红素,粗品产量达475 mg/L.

关键词：粘质沙雷氏菌灵菌红素筛选鉴定

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苦瓜枯萎病病菌的鉴定及防效初探

苦瓜枯萎病病菌的鉴定及防效初探

农杆菌介导的紫色红曲霉遗传转化体系的建立和优化

中国植物病理学会第九届全国会员代表大会暨2010年学术年会

作者：杨叶嵇豪蔡琪敏汪鹏荣蓝丽精蒋冬花浙江师范大学化学与生命科学学院

自浙江省金华市苦瓜种植田采集到280株苦瓜的枯萎病病株,采用组织分离法,获得310株病原菌菌株;根据培养、形态特征以及分子学特征,鉴定为由尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporumSchl.)侵染引起。对该尖孢镰孢菌(***)进行致病性及寄主专化型测... 详细信息

自浙江省金华市苦瓜种植田采集到280株苦瓜的枯萎病病株,采用组织分离法,获得310株病原菌菌株;根据培养、形态特征以及分子学特征,鉴定为由尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporumSchl.)侵染引起。对该尖孢镰孢菌(***)进行致病性及寄主专化型测定,结果表明该病原菌对苦瓜有明显的致病性,但不侵染其他测试的瓜类,证明该苦瓜枯萎病是由尖孢镰孢菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum *** Sun&Huang)引起,并将该菌株命名为菌株***.m。以***.m为试验材料,研究了在离体条件下,壳聚糖的分子量与浓度对该病菌的影响。结果表明,壳聚糖作用后***.m的菌丝形态发生畸变,新陈代谢和细胞壁结构发生较明显的变化;除分子量5.0×10的壳聚糖外,其他分子量较大的壳聚糖对该病菌的抑菌效果随分子量的增大而增强;分子量相同的情况下,壳聚糖的抑菌效果则随其浓度的增大而增强;壳聚糖作用后***.m的可溶性蛋白也发生了较大变化,且与壳聚糖的分子量与浓度相关。采用针剌浸根法接种苦瓜幼苗,测定了7个苦瓜品种苗期对枯萎病的抗性,结果显示兴蔬春燕、大白苦瓜、翠绿嫩玉、绿先锋杂交4个品种的苦瓜对苦瓜枯萎病表现为易感,长白苦瓜、精选长绿和青皮苦瓜3个品种的苦瓜对枯萎病表现为中等抗性,且尚未发现有高抗苦瓜枯萎病的苦瓜品种。选取易感品种兴蔬春燕、绿先锋杂交,中抗品种精选长绿、长白苦瓜,进行特定分子量壳聚糖诱导其抗枯萎病的初步防效性研究,结果表明该壳聚糖能不同程度地提高苦瓜对枯萎病的抗性(发病率降低4.8%～15.7%),且能较明显地提高易感品种绿先锋杂交与兴蔬春燕对苦瓜枯萎病的抗性,而对中抗品种长白苦瓜、精选长绿抗性的提高,表现较不明显。

关键词：苦瓜尖孢镰孢菌鉴定壳聚糖抑菌活性抗性测定

来源： cnki会议评论

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微生物学杂志 2010年第5期30卷 68-73页

作者：蔡琪敏蒋冬花嵇豪蓝丽精浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004

通过优化各种转化因素,建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导红曲霉(Monascus)的高效转化体系:红曲霉在PDA培养基培养21 d后收集孢子,制备红曲霉孢子悬浮液,浓度为106个/mL,根癌农杆菌浓度为OD600值0.5,诱导剂AS浓度为100μ... 详细信息

通过优化各种转化因素,建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导红曲霉(Monascus)的高效转化体系:红曲霉在PDA培养基培养21 d后收集孢子,制备红曲霉孢子悬浮液,浓度为106个/mL,根癌农杆菌浓度为OD600值0.5,诱导剂AS浓度为100μmol/L,农杆菌与红曲霉在25℃共培养3 d。采用此转化体系构建了含有530多个转化子的红曲霉T-DNA插入突变体库。随机选取50株转化子菌株进行分子验证和稳定性检测,证明T-DNA成功插入红曲霉基因组DNA中,并能稳定遗传。最后,通过形态观察筛选出8株变异较大的菌株,为以后的红曲霉基因功能研究奠定了一定的基础。

关键词：红曲霉根癌农杆菌 T-DNA 突变体库