检索结果-南通市图书馆

作者：蒲路莎黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

星状病毒(Astrovirus,AstV)是一种没有囊膜且单股正链的RNA病毒,属于星状病毒科。该病毒目前已从多种哺乳动物以及鸡、火鸡、鸭、鹅和鸽子等禽类中检测出来,与多种动物的腹泻疾病有关。自2017年,在我国山东、安徽、广东、湖南和江苏等... 详细信息

星状病毒(Astrovirus,AstV)是一种没有囊膜且单股正链的RNA病毒,属于星状病毒科。该病毒目前已从多种哺乳动物以及鸡、火鸡、鸭、鹅和鸽子等禽类中检测出来,与多种动物的腹泻疾病有关。自2017年,在我国山东、安徽、广东、湖南和江苏等地陆续出现雏鹅内脏型痛风病的报道,鹅源星状病毒是引起该病的病原,其致死率可达30%以上,导致养鹅产业严重的经济损失。本研究利用RT-PCR检测鹅源星状病毒阳性;收集结果为阳性的死亡鹅病料的内脏研磨上清进行病毒分离;分离获得两株稳定繁殖的星状病毒毒株:GAstV/Goose/2019/HLJPF和GAstV/Goose/2018/HLJ01;其中GAstV/Goose/2019/HLJPF的ELD为10/0.2mL。鹅胚分离传代结果表明病毒接种鹅胚可使胚体全身出血、体生长发育受到抑制或死亡等病变。分析NCBI上公布的GAstV序列,设计合成了一组引物,采取了RT-PCR技术来扩增GAstV的基因组片段,获取GAstV的核酸序列进而拼接GAstV的全基因组,并分析了GAstV的结构组成、抗原表位、系统发育与重组以及氨基酸的突变。测序与分析的结果显示GAstV/Goose/2019/HLJPF与GAstV/Goose/2018/HLJ01的病毒基因组全长分别为7 233bp和7 166 bp,编码3个开放阅读框(ORFs),即ORF1a、ORF1b和ORF2。对2株GAstV病毒的序列进行系统发育分析显示它们属于Avastrovirus,并与Avastrovirus 3和TURKEY Astrovirus有密切关系。此外,ORF1a和ORF2的突变率较高。突变的ORF2蛋白三级结构光滑,其抗原表位高度突变,这可能与病毒的致病性有关,是由宿主的抗体压力引起的。基于鹅源星状病毒的遗传学以及生物特性,本研究采取了原核蛋白表达系统对HLJ01株ORF2衣壳蛋白进行了原核表达,利用纯化后获得的重组ORF2蛋白免疫小鼠制备了针对GAstV ORF2衣壳蛋白的多克隆抗体。同时针对保守区域设计了一对特异性引物,建立了用于检测鹅源星状病毒的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。综上所述,本研究对鹅源星状病毒进行了分离鉴定,同时开展了鹅源星状病毒的生物学特性的研究,并对其基因组序列进行了系统发育分析,预测其蛋白结构功能,建立了用于检测鹅源星状病毒的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,制备了针对其衣壳蛋白的特异性多克隆抗体。为进一步掌握GAstV的发生发展而提供了部分的实践基础和理论支持。

关键词：鹅源星状病毒分离鉴定遗传进化分析原核表达荧光定量PCR

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鹅源星状病毒ORF2基因原核表达及遗传进化分析

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浙江农业学报 2020年第5期32卷 789-797页

作者：蒲路莎苏世博陈肖韩赵丽丽陈洪岩黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱... 详细信息

应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱导表达的蛋白经镍亲和层析柱纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western-blotting结果显示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV阳性血清识别。序列分析表明,该毒株与其他鹅源星状病毒参考毒株的核苷酸相似性介于37.8%~99.3%之间,HLJ-1801分离株与已发表的8株鹅源星状病毒毒株位于同一分支,表明其属于一种新型星状病毒成员。利用原核表达系统成功高效地表达了GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在。本试验成功获得了纯化的ORF2重组蛋白和小鼠抗GoAstV多克隆抗体,为进一步研究ORF2蛋白对星状病毒感染的诊断试剂的研发奠定了基础。

关键词：鹅星状病毒 ORF2 原核表达遗传进化分析

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鹅源星状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

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中国比较医学杂志 2021年第3期31卷 43-48页

作者：苏世博蒲路莎陈肖韩赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室/国家禽类实验动物资源库哈尔滨150069

目的建立一种可快速诊断鹅源星状病毒的荧光定量PCR方法。方法分析比对NCBI下载的鹅源星状病毒全基因组序列,在其ORF1a保守区设计一对特异性引物及Taq Man探针,优化反应条件,建立标准曲线,并验证其特异性,敏感性和稳定性。结果该方法最... 详细信息

目的建立一种可快速诊断鹅源星状病毒的荧光定量PCR方法。方法分析比对NCBI下载的鹅源星状病毒全基因组序列,在其ORF1a保守区设计一对特异性引物及Taq Man探针,优化反应条件,建立标准曲线,并验证其特异性,敏感性和稳定性。结果该方法最低检测线限为1.50×10^(2)copies/μL,批内和批间检测变异系数分别小于0.5%和4%,且对其他常见水禽病毒无特异性扩增。临床应用结果显示检出率明显高于常规RT-PCR方法。结论建立了一种鹅源星状病毒的Taq Man荧光定量PCR方法,该方法特异性强,灵敏度高且重复性良好,适用于鹅源星状病毒的早期检测和定量分析。

关键词：鹅源星状病毒荧光定量PCR 雏鹅痛风检测方法

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具有中和活性的鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

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中国兽医科学 2019年第8期49卷 977-982页

作者：王怡平张忠伟蒲路莎赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069 吉林省松原市宁江区畜牧业管理局吉林松原138001

为制备抗鸭肠炎病毒(DEV)的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行鉴定,本研究采用蔗糖密度梯度离心法提纯DEV鸭胚成纤维细胞适应毒,以此作为抗原免疫BALB/c小鼠,随后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,有限稀释法克隆杂交瘤细胞株,经间... 详细信息

为制备抗鸭肠炎病毒(DEV)的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行鉴定,本研究采用蔗糖密度梯度离心法提纯DEV鸭胚成纤维细胞适应毒,以此作为抗原免疫BALB/c小鼠,随后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,有限稀释法克隆杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗DEV MAb的杂交瘤细胞株2E3。鉴定结果显示,该MAb为Ig M亚类,ELISA效价可达到1∶10~5以上;间接免疫荧光试验(IFA)中MAb可与细胞中增殖的DEV结合,Western-blot试验中MAb不与变性病毒蛋白作用,表明该MAb可能是构象表位的单抗;病毒中和试验表明,该MAb具有较强的病毒中和活性。上述结果表明,本试验获得的一株具有DEV中和活性的MAb杂交瘤细胞株为建立DEV的检测方法和DEV的相关研究提供了材料支持。

关键词：鸭肠炎病毒单克隆抗体中和活性

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