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抗克伦特罗核糖体展示单链抗体文库的构建及鉴定

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食品科学 2011年第15期32卷 200-204页

作者：刘细霞孙远明董洁娴杨武英谢曦王弘华南农业大学食品学院广东省食品质量安全重点实验室广东广州510640

构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体(single-chain fragment variant,scFv)文库,为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠,分离其脾细胞;Trizol法抽提总RNA,反转录成cDNA,PCR及重叠延伸PCR法构建核糖体展示scFv文库... 详细信息

构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体(single-chain fragment variant,scFv)文库,为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠,分离其脾细胞;Trizol法抽提总RNA,反转录成cDNA,PCR及重叠延伸PCR法构建核糖体展示scFv文库。再通过PCR和重叠延伸PCR在scFv文库序列5'端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,3'端添加间隔区序列(T20-V109)、茎环结构构建核糖体展示抗克伦特罗scFv文库。核糖体展示scFv文库与Easy T3载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑取5个阳性克隆双酶切和测序鉴定。结果表明:用于建库材料的免疫小鼠效价为1:128000;成功扩增重链可变区基因大约为360bp和轻链可变区基因大约为330pb;核糖体展示scFv文库基因大约1200bp;库容量达1.75×1013;阳性重组质粒均含有1200bp插入片段;利用IMGT/V-QUEST数据库对单链抗体可变区进行序列分析结果表明,重链可变区和轻链可变区基因均由胚系基因重排得到,且与鼠源胚系基因同源率都达84%以上;氨基酸序列比对结果表明,重链可变区氨基酸序列同源率为37.82%,轻链可变区氨基酸序列同源率为39.09%。其中多样性主要发生在VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。成功构建了大容量抗克伦特罗单链抗体核糖体展示文库。

关键词：核糖体展示克伦特罗单链抗体文库

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纳米抗体的稳定性及其结构基础研究进展

生物化学与生物物理进展 2022年第6期49卷 1004-1017页

作者：何晓婷董洁娴沈兴王弘沈玉栋徐振林华南农业大学食品学院广东省食品质量安全重点实验室广州510642 深圳清华大学研究院抗肿瘤创新药物研发中心深圳518057

驼类纳米抗体结构简单、易于改造,且具有低免疫原性、高稳定性、高特异性、高亲和力等特点,因而具有广泛的应用前景。纳米抗体的优势之一在于其具有较高的稳定性,比常规抗体更易于储藏和运输,甚至在高温、化学和压力等极端条件下变性后... 详细信息

驼类纳米抗体结构简单、易于改造,且具有低免疫原性、高稳定性、高特异性、高亲和力等特点,因而具有广泛的应用前景。纳米抗体的优势之一在于其具有较高的稳定性,比常规抗体更易于储藏和运输,甚至在高温、化学和压力等极端条件下变性后仍可有效地重折叠并恢复其抗原亲和力。本文综述了纳米抗体稳定性与其结构基础方面的研究进展,阐述了纳米抗体氨基酸序列、二硫键、结构域等与其稳定性的关系,揭示了高度稳定性的纳米抗体普遍具有的结构特征。基于这些结构特征,讨论了几种纳米抗体的稳定性优化策略,包括共有序列驱动的序列修复、替换易于修饰的氨基酸、净蛋白质电荷的改变、非天然二硫键的引入以及CDR超变区的移植。预期对纳米抗体的稳定性调控提供理论指导,以拓展其作为治疗药物、诊断试剂和生物传感器等方面的应用。

关键词：纳米抗体稳定性结构序列二硫键

重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展

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生物工程学报 2012年第5期28卷 557-564页

作者：董洁娴李振峰雷红涛何永盛王弘孙远明华南农业大学食品学院广东省食品质量安全重点实验室广东广州510640

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是酶抑制法检测农药残留的核心试剂。但天然提取的AChE存在含量低、纯化困难、稳定性差等不足,因此,高性能的重组AChE制备成为研究学者关注的热点。文中综述了重组AChE的表达、和分子进化等方... 详细信息

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是酶抑制法检测农药残留的核心试剂。但天然提取的AChE存在含量低、纯化困难、稳定性差等不足,因此,高性能的重组AChE制备成为研究学者关注的热点。文中综述了重组AChE的表达、和分子进化等方面的研究成果,并指出酶定向进化策略与表面展示技术结合是重组AChE活性改造的未来趋势。

关键词：农药残留重组乙酰胆碱酯酶酶抑制检测法

抗孔雀石绿单链抗体-碱性磷酸酶融合表达和活性鉴定

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食品科学 2016年第17期37卷 121-126页

作者：伍伟健董洁娴饶美芳詹屋强王弘孙远明广东省食品质量安全重点实验室华南农业大学食品学院广东广州510642

采用重叠延伸的方法成功将抗孔雀石绿(malachite green,MG)单克隆细胞的轻链VL和重链VH用连接肽(Gly_4Ser)_3连接,形成单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因,并将其酶切连接进入含有碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,PhoA)基因的载体plip6/GN中,成功构建重组质粒plip6/GN-MG-scFv。随后重组质粒转入大肠杆菌BL21,经诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting鉴定结果表明所获得的融合蛋白sc Fv-PhoA大小约72 kD。利用scFv与MG特异性结合的活性和PhoA催化对硝基苯磷酸二钠的显色机制,经过直接竞争酶联免疫吸附法测定融合蛋白scFv-PhoA的IC_(50)为9.81 ng/mL。本方法操作简单、灵敏度高且检测时间短,这为进一步进行MG免疫法快速检测提供了参考。

关键词：孔雀石绿单链抗体碱性磷酸酶融合表达直接竞争酶联免疫吸附法

基于定点突变的抗克百威单链抗体的亲和力成熟

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高等学校化学学报 2012年第11期33卷 2486-2491页

作者：邓龙肖治理董洁娴王弘杨武英谢曦杨金易沈玉栋孙远明广东省食品质量安全重点实验室华南农业大学食品质量与安全研究所广州510642

为获得亲和力更高的抗克百威(CBF)单链抗体(scFv),从抗CBF scFv氨基酸序列出发,通过同源模建获得抗体模型,找出抗体中的活性口袋区域,进而将小分子药物与抗体进行分子对接,发现疏水作用和氢键对于抗体亲和力具有重要作用.进一步对口袋... 详细信息

为获得亲和力更高的抗克百威(CBF)单链抗体(scFv),从抗CBF scFv氨基酸序列出发,通过同源模建获得抗体模型,找出抗体中的活性口袋区域,进而将小分子药物与抗体进行分子对接,发现疏水作用和氢键对于抗体亲和力具有重要作用.进一步对口袋内亲水氨基酸残基HArg40和LHis38进行模拟替换,再进行分子对接分析,发现当以亮氨酸为突变氨基酸时,对接评分最高.在此基础上,通过构建突变scFv基因及可溶性表达,采用ELISA法对进化后的单链抗体(evoscFv)进行了鉴定.结果表明,evoscFv对CBF的IC50值为18.11μg/L,低于野生型抗体的27.25μg/L,亲和解离常数Kd为4.06×10-8mol/L,相对亲和力比野生型scFv提高了2.23倍,说明通过分子对接分析及对抗体活性口袋中氨基酸残基进行替换,获得了一个亲和力更高的突变体抗体.

关键词：克百威单链抗体分子对接定点突变亲和力成熟

虾肉中呋喃它酮代谢物化学发光酶免疫分析方法的建立

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分析化学 2012年第12期40卷 1816-1821页

作者：杨武英董洁娴沈玉栋杨金易王弘徐振林杨星星孙远明广东省食品质量安全重点实验室华南农业大学食品学院江西农业大学食品科学与工程学院

采用对碘苯酚增强的HRP-鲁米诺-H2O2化学发光体系,建立了虾肉中呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)残留的间接竞争化学发光酶免疫分析(icCLEIA)检测方法。检测所用抗体是基因重组的抗AMOZ衍生物单链抗体。优化的icCLEI... 详细信息

采用对碘苯酚增强的HRP-鲁米诺-H2O2化学发光体系,建立了虾肉中呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)残留的间接竞争化学发光酶免疫分析(icCLEIA)检测方法。检测所用抗体是基因重组的抗AMOZ衍生物单链抗体。优化的icCLEIA最佳工作条件为:AMOZA-OVA包被浓度62.5μg/L,抗AMOZ衍生物单链抗体最佳稀释度为1∶10,竞争免疫反应时间45 min,HRP酶标记羊抗鼠抗体最佳稀释度为1∶10000,孵育时间50 min。本方法的IC50为1.38μg/L;灵敏度为0.09μg/L;线性范围为0.26～9.08μg/L(IC20～IC80);批内和批间相对标准偏差均小于15%;抗AMOZ衍生物单链抗体与其它硝基呋喃类抗生素及其代谢物均没有交叉反应,特异性良好。4个不同添加量的AMOZ加标样品的平均回收率分别为72.2%,73.4%,72.6%和78.6%。与HPLC-MS/MS法测定值进行比较发现,两种方法相关性良好(R2=0.9997)。本方法可用于水产品中AMOZ残留的快速检测。

关键词：呋喃它酮代谢物AMOZ 刀额新对虾间接竞争化学发光酶免疫分析辣根过氧化物酶

来源：博看期刊

家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace在毕赤酵母GS115中的表达及其分析

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中国农业科学 2012年第11期45卷 2189-2198页

作者：何永盛陈舒迟王弘韩双艳杨琼刘细霞董洁娴杨武英孙远明广东省食品质量与安全重点实验室/华南农业大学食品质量与安全研究所华南理工大学生物科学与工程学院广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所

【目的】构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶(BmAChE)的毕赤酵母菌株,实现BmAChE在毕赤酵母中分泌表达并对其活性进行分析。【方法】从家蚕头部提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace并进行序列测定。采用PCR... 详细信息

【目的】构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶(BmAChE)的毕赤酵母菌株,实现BmAChE在毕赤酵母中分泌表达并对其活性进行分析。【方法】从家蚕头部提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace并进行序列测定。采用PCR及重叠延伸PCR去除原bmace中的信号肽和疏水肽,并对序列中存在的2个A+T富含区进行同义密码子替换的改造。将改造后的bmace与表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,以Ellman法测定酶活力,毒扁豆碱和有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组BmAChE(rBmAChE)的生物活性。【结果】改造后的bmace经重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为70 kD的蛋白,具有AChE活性,酶比活力约为1 187 ***-1。抑制试验显示,该rBmAChE能够被毒扁豆碱强烈抑制,并且可被皮蝇磷等10种有机磷农药和克百威等5种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC50值可达2.78×10-10mol.L-1。【结论】成功构建分泌表达BmAChE的毕赤酵母菌株,其表达了具有良好活性的rBmAChE,可用于进一步制备有机磷及氨基甲酸酯类农药快速检测分析制剂。

关键词：毕赤酵母重组家蚕乙酰胆碱酯酶表达活性分析有机磷农药氨基甲酸酯类农药

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“中国语言生活研究二十年”多人谈

语言战略研究 2025年第01期 5-11页

作者：陈平周庆生赵世举赵守辉刘海涛方小兵董洁澳大利亚昆士兰大学语言与文化学院江苏师范大学语言科学与艺术学院中国社会科学院民族学与人类学研究所武汉大学文学院/中国语情与社会发展研究中心挪威卑尔根大学人文学院复旦大学外文学院南京大学中国语言战略研究中心清华大学外文系

网文是语言生活研究的一个新课题陈平（澳大利亚昆士兰大学语言与文化学院）传统语言研究大多专注于语言本体。1960年代开始，社会语言学渐渐成为国际主流语言研究的一部分。1980年代之后，社会语言学在中国兴起，许多大学开设了社会语...

网文是语言生活研究的一个新课题陈平（澳大利亚昆士兰大学语言与文化学院）传统语言研究大多专注于语言本体。1960年代开始，社会语言学渐渐成为国际主流语言研究的一部分。1980年代之后，社会语言学在中国兴起，许多大学开设了社会语言学课程，学术期刊也经常刊发高质量的社会语言运用调查报告。

关键词：

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综合处理铜选矿尾渣和镍熔融渣的工艺研究

稀有金属 2014年第1期38卷 108-114页

作者：袁守谦董洁王超王治均西安建筑科技大学冶金工程学院陕西西安710055

金川公司废弃的铜选矿尾渣和镍熔融渣含铁30％-40％，FeO＋SiO2含量大于90％。根据弃渣的成分特点，提出了一种综合处理铜选矿尾渣和镍熔融渣的提铁炼钢工艺：将铜选矿尾渣和碳质还原剂进行造块，在矿热炉中熔化还原，冶炼低牌号硅铁，... 详细信息

金川公司废弃的铜选矿尾渣和镍熔融渣含铁30％-40％，FeO＋SiO2含量大于90％。根据弃渣的成分特点，提出了一种综合处理铜选矿尾渣和镍熔融渣的提铁炼钢工艺：将铜选矿尾渣和碳质还原剂进行造块，在矿热炉中熔化还原，冶炼低牌号硅铁，再将热态的含硅铁水与热态的镍熔融渣兑入摇炉，并加石灰控制碱度，冶炼出还原铁水。经过理论分析计算，利用31．2kg焦炭在矿热炉中熔化还原100kg铜选矿尾渣，可以冶炼出57．3kg的含硅28％的硅铁合金。用硅铁还原镍熔融渣，冶炼1t还原铁水需要镍熔融渣1470kg，铜选矿尾渣1060kg，干焦炭298kg，石灰911kg。充分利用热态的含硅铁水和镍熔融渣两种热能，用石灰的烘烤温度调节控制摇炉内温度，避免突然爆发的大喷溅，预期可以实现回收渣中绝大部分有价金属的目的。并将产生的炉渣用于制作无机非金属建筑材料，实现弃渣的综合利用。理论分析表明该工艺利用两种弃渣进行提铁是可行的。

关键词：铜渣镍渣提铁矿热炉摇炉