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人VIGILIN参与调控肝癌细胞H19和IGF2印记基因表达的研究

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四川大学学报（医学版） 2009年第5期40卷 770-774页

作者：葛亚俊谢晓砚杨博柴新娟张迎春覃扬四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的探讨人高密度脂蛋白结合蛋白基因(VIGILIN)是否参与肝癌细胞在细胞周期中印记基因H19和胰岛素样生长因子2(IGF2)表达的调控。方法通过流式细胞术检测人肝癌细胞HepG2细胞周期选择周期点,采用RT-PCR、RNA干扰、实时荧光定量RT-PCR检... 详细信息

目的探讨人高密度脂蛋白结合蛋白基因(VIGILIN)是否参与肝癌细胞在细胞周期中印记基因H19和胰岛素样生长因子2(IGF2)表达的调控。方法通过流式细胞术检测人肝癌细胞HepG2细胞周期选择周期点,采用RT-PCR、RNA干扰、实时荧光定量RT-PCR检测各周期点VIGILIN、H19、IGF2基因表达。结果①HepG2细胞周期约为20h;其中0～9h、20～28h约为S期,9～20h、28～39h约为G2/M、G1期,并选定6h、20h、43h、60h,分别代表S期中期、G1～S期、S期中期和G1期末;②细胞周期同步化后加入血清,刺激VIGILIN转录,上调VIGILIN的表达,从G2/M至G1期,逐渐增加,G1期末达高峰,S期逐渐减少;与之相反,H19的表达,在S期逐渐增加,在G2/MG1期逐渐减少,在S期中期达到高峰。而IGF2的表达也增加但没有明显的周期性。H19与VIGILIN mRNA表达呈负相关(r=-0.6941,P<0.05)。③用VIGILIN shRNA(pSIREN-VIG shRNA)重组载体转染HepG2细胞48h后,相对于3个对照组(未转染组,脂质体转染组和转染pSIREN-GFP shRNA组),实验组VIGILIN mRNA的表达受到明显抑制,此时,IGF2mRNA表达增加30.13%,H19mRNA表达减少12.08%。结论VIGILIN和H19 mRNA表达与细胞周期有关;VIGILIN参与调控H19、IGF2印记基因的表达。

关键词：高密度脂蛋白结合蛋白 H19/IGF2 mRNA表达细胞周期细胞增殖

中药成分CDP对乳腺癌细胞P16,E-CADHERIN去甲基化作用的研究

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四川大学学报（医学版） 2009年第5期40卷 798-802页

作者：柴新娟栾菊杨文理张迎春葛亚俊覃扬四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的探讨中药成分CDP对乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435的抑癌基因P16和E-CADHERIN启动子区CpG岛的去甲基化作用。方法培养人乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435,分别用不同剂量、同一剂量不同时间的CDP和5-azacytidine(5-aza-C)处理细胞;用甲... 详细信息

目的探讨中药成分CDP对乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435的抑癌基因P16和E-CADHERIN启动子区CpG岛的去甲基化作用。方法培养人乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435,分别用不同剂量、同一剂量不同时间的CDP和5-azacytidine(5-aza-C)处理细胞;用甲基化特异性PCR(MSP)和半定量RT-PCR,检测细胞中P16和E-CADHERIN基因的甲基化改变和RNA表达恢复情况。结果①在25、50、75和100μmol/L剂量的CDP持续作用6d后,T47D细胞P16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带减弱,在100μmol/L剂量时消失,在4个剂量CDP作用下,非甲基化特异性条带均重新出现;在75和100μmol/L浓度作用下时,T47D细胞中出现P16基因重新表达;②在50μmol/LCDP作用144h后,T47DP16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍存在;非甲基化特异性条带24h出现并持续到144h;在药物作用144h时,P16出现表达。③在MDA-MB-435细胞中,用不同剂量CDP处理或同一剂量CDP处理不同时间后,均未观察到E-CADHERIN非甲基化条带的出现,RT-PCR也未检测到E-CADHERIN基因的表达。结论在T47D细胞中,中药成分CDP可以剂量、时间依赖的形式逆转高甲基化的P16基因,而对MDA-MB-435细胞中高甲基化的E-CADHERIN基因无效,提示CDP药物存在靶分子反应多样性。

关键词：中药成分CDP P16 E-CADHERIN 去甲基化 T47D MDA—MB-435

人CTCF N端融合蛋白的表达、抗体制备及鉴定

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生物医学工程学杂志 2010年第2期27卷 379-383页

作者：张迎春蒋磊魏玲柴新娟葛亚俊覃扬四川大学华西医学中心生物化学与分子生物学教研室成都610041

为研究CTCF的功能,进一步探索肿瘤的发病机制,我们成功制备了人转录因子CTCF N端融合蛋白多克隆抗体,并初步用于肿瘤细胞CTCF表达状态的分析。采用已构建的表达质粒PGEX-4T-2-CTCF-N,经IPTG诱导表达GST-CTCF N融合蛋白,亲和层析纯化GST-... 详细信息

为研究CTCF的功能,进一步探索肿瘤的发病机制,我们成功制备了人转录因子CTCF N端融合蛋白多克隆抗体,并初步用于肿瘤细胞CTCF表达状态的分析。采用已构建的表达质粒PGEX-4T-2-CTCF-N,经IPTG诱导表达GST-CTCF N融合蛋白,亲和层析纯化GST-CTCF N融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。并通过Western blot,对肿瘤细胞和组织CTCF蛋白表达状态进行初步分析。本实验成功在大肠杆菌BL21中诱导表达了GST-CTCF N融合蛋白,经亲和层析纯化获得了纯化的融合蛋白。免疫新西兰大白兔获得了较高生物活性和特异性的多克隆抗体,Western blot证实此多克隆抗体能够特异性识别HepG2、HeLa、MCF-7癌细胞及组织的内源性CTCF蛋白,为今后从蛋白质水平研究CTCF基因表达调控研究打下了基础。

关键词： CTCF 多克隆抗体 Western blot 肿瘤细胞表达

甘肃省鼠疫耶尔森菌规律成簇间隔短回文重复序列位点多态性分析及地区分布

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中华流行病学杂志 2020年第12期41卷 2125-2130页

作者：苏永强郭丽民葛亚俊席进孝王宇萌苗克军吴斌徐大琴甘肃省疾病预防控制中心鼠疫防制科兰州730020 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心 201058 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所北京102206

目的研究甘肃省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)位点多态性及地区分布。方法选取1962-2014年分离的203株鼠疫菌,培养并提取DNA。采用3对CRISPR引物对菌株DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行测序。根据菌株CRISP... 详细信息

目的研究甘肃省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)位点多态性及地区分布。方法选取1962-2014年分离的203株鼠疫菌,培养并提取DNA。采用3对CRISPR引物对菌株DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行测序。根据菌株CRISPR位点的间区序列种类和排列情况,确定菌株的基因型(类群),采用BioNumerics 5.10软件进行聚类分析。结果203株鼠疫菌发现有16种间区序列,包括YPa位点9种、YPb位点4种、YPc位点3种,发现新的间区序列a1′。共发现5个CRISPR基因簇,分别为Cb2、Ca7、Ca7′、CaΔ5′、Ca35′。不同的基因簇呈现区域性特征:Cb2主要分布在会宁县、平川区,Ca7主要分布阿克塞哈萨克族自治县;Ca7′主要分布在夏河县;Ca35′主要分布肃北蒙古族自治县、玉门市;CaΔ5′主要集中在肃南裕固族自治县。结论CRISPR分子分型方法能够较好地区分甘肃省不同疫源地的菌株,且各基因簇呈现一定的区域性特征。对研究甘肃省鼠疫菌进化规律和人间疫情分子生物学溯源有一定意义。

关键词：鼠疫耶尔森菌规律成簇的间隔短回文重复序列基因型

规律成簇的间隔短回文重复序列对甘肃省鼠疫菌株的基因分型研究

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中华地方病学杂志 2017年第6期36卷 404-407页

作者：葛亚俊格鹏飞席进孝李伟张宏马娜吴斌郭丽民徐大琴甘肃省疾病预防控制中心鼠疫防治科兰州730000 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所鼠疫室北京102206 吉林省地方病第一防治研究所鼠疫室白城137000

目的对甘肃省鼠疫菌株进行基因分型，分析不同生态型鼠疫菌株在不同行政地区、不同时间的流行趋势。方法运用规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）对甘肃省甘宁黄鼠型（9株）、阿尔金型（18株）、祁连型（45株）及青藏型鼠疫菌株（... 详细信息

目的对甘肃省鼠疫菌株进行基因分型，分析不同生态型鼠疫菌株在不同行政地区、不同时间的流行趋势。方法运用规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）对甘肃省甘宁黄鼠型（9株）、阿尔金型（18株）、祁连型（45株）及青藏型鼠疫菌株（121株）进行分型及遗传进化关系分析，分型按国际通用标准命名。并探讨甘肃省不同行政地区和不同流行时间CRISPR基因分型的变化情况。结果甘肃省鼠疫菌株被分为2个CRISPR基因簇（Ca7和Cb4），4个基因型（7、22、24及26型）。从来源地看，阿克塞、肃北、玉门、肃南均以24型［36.36%（16／44）、36.17%（17／47）、50.00%（5／10）、38.67%（29／75）］为主基因型，夏河、会宁均以26型（4／7）为主基因型，山丹以22型（1／1）为主基因型。从时间上看，甘肃省1960 - 1969、1970 - 1979、1980 - 1989年鼠疫菌均以26型［53.33%（8／15）、60.00%（6／10）、48.28%（14／29）］为主基因型，1990 - 1999年以22型［40.91%（18／44）］为主基因型，2000 - 2009年以24型［43.16%（41／95）］为主基因型。结论甘肃省鼠疫菌基因型在不同行政地区、不同时间流行趋势不同。

关键词：耶尔森菌鼠疫生态型基因分型

甘肃省鼠疫耶尔森菌多位点可变数目串联重复序列基因分型及地区分布

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中国人兽共患病学报 2021年第8期37卷 715-721页

作者：郭丽民席进孝葛亚俊王宇萌苗克军吴斌徐大琴甘肃省疾病预防控制中心兰州730020 复旦大学附属公共卫生临床中心上海201058 中国疾病预防控制中心北京102206

目的采用多位点可变数目串联重复序列(MLVA)对甘肃省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)进行基因分型,探讨甘肃省鼠疫菌地区分布特征。方法选取1962-2014年间甘肃省各市县(区)不同生态型的鼠疫菌198株,培养并提取基因组DNA。采用14+12对引物进行PCR扩... 详细信息

目的采用多位点可变数目串联重复序列(MLVA)对甘肃省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)进行基因分型,探讨甘肃省鼠疫菌地区分布特征。方法选取1962-2014年间甘肃省各市县(区)不同生态型的鼠疫菌198株,培养并提取基因组DNA。采用14+12对引物进行PCR扩增,产物进行测序,确定每对引物串联重复序列(VNTR)位点的拷贝数。应用BioNumerics 5.10软件对菌株的VNTR位点拷贝数进行聚类分析。结果甘肃省鼠疫菌分为10个群,群内的菌株依据分离地点继续细化为5-28个分支。10个群分别为:阿拉善黄鼠疫源地菌株聚为1个群;甘南高原疫源地菌株聚成1个群;阿克塞县菌株分成2个群,为当金山群和加尔乌宗村群;肃北县菌株分为3个群,为马场群、党城湾镇群和鱼儿红群;玉门市菌株聚集在肃北县鱼儿红群内;肃南县菌株分为3个群,为大河乡群、马蹄乡群和康乐乡群。结论MLVA可以清晰地区分甘肃省不同鼠疫疫源地的菌株,将疫源地内菌株继续细分为不同分支,直至精确的分离地点。MLVA分型方法可用于鼠疫菌株的溯源分析。

关键词：鼠疫耶尔森菌 MLVA 地区分布

甘肃省鼠疫菌株多位点可变数目串联重复序列分析及流行病学特征分析

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中华流行病学杂志 2015年第3期36卷 297-298页

作者：郭丽民席进孝张宏苗克军吴斌葛亚俊徐大琴周晓艳甘肃省疾病预防控制中心兰州730000

本研究利用中国疾病预防控制中心传染病预防控制所鼠疫室选出的15对多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）引物应用于甘肃省鼠疫菌株的分析。1．材料与方法：（1）材料：202株鼠疫菌均分离于1962-2009年甘肃省鼠疫疫源地境内，保存于... 详细信息

本研究利用中国疾病预防控制中心传染病预防控制所鼠疫室选出的15对多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）引物应用于甘肃省鼠疫菌株的分析。1．材料与方法：（1）材料：202株鼠疫菌均分离于1962-2009年甘肃省鼠疫疫源地境内，保存于甘肃省疾病预防控制中心鼠疫菌库。

关键词：鼠疫菌多位点可变数目串联重复序列分析

甘肃省鼠疫菌株差异区段基因分型及其流行病学特征

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中国地方病防治 2016年第8期31卷 862-863页

作者：郭丽民张宏吴斌苗克军徐大琴葛亚俊席进孝甘肃省疾病预防控制中心甘肃兰州730020

目的研究甘肃省鼠疫菌差异区段基因分型及其流行特征。方法根据鼠疫菌基因组的23个差异区段(DFR)对202株鼠疫菌进行基因分型,并进行聚类分析。结果 202株鼠疫菌分为8个基因型,即1b型、5型、7型、8型、13型、26型及新发现的GS1型和GS2型... 详细信息

目的研究甘肃省鼠疫菌差异区段基因分型及其流行特征。方法根据鼠疫菌基因组的23个差异区段(DFR)对202株鼠疫菌进行基因分型,并进行聚类分析。结果 202株鼠疫菌分为8个基因型,即1b型、5型、7型、8型、13型、26型及新发现的GS1型和GS2型。9株黄鼠型菌株被分为13型和26型。18株阿尔金型菌株被分为3个型,其中1株为GS2型,6株为8型,11株为1b型。48株祁连型被分为3个型,其中5株为8型,39株为GS1型,4株为GS2型。127株青藏型菌株被分为6个型,其中1株为5型,6株为7型,56株为8型,39株为1b型,20株为GS1型,5株为GS2型。黄鼠型鼠疫菌的主基因型为26型,阿尔金型鼠疫菌的主基因型为1b型,祁连型鼠疫菌的主基因型为GS1型,青藏型鼠疫菌的主基因型为8型。结论 GS1和GS2为新发现的2个新基因型。黄鼠型鼠疫菌株同阿尔金型、祁连型和青藏型菌株基因型相似度较小,阿尔金型、祁连型和青藏型基因型相似度较大。

关键词：鼠疫菌差异区段基因分型流行病学

HP1α与EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的稳定表达

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