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芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的重要成员,该病毒寄主范围广泛,可侵染43科156属的300多种植物,是唯一可以侵染芸薹属植物的马铃薯Y病毒属病毒(potyviruses)。目前该病... 详细信息

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的重要成员,该病毒寄主范围广泛,可侵染43科156属的300多种植物,是唯一可以侵染芸薹属植物的马铃薯Y病毒属病毒(potyviruses)。目前该病毒已成为世界范围内危害蔬菜最严重的5种病毒之一,仅次于黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV),尤其是对十字花科蔬菜造成严重威胁,直接影响农作物的产量和品质。研究Tu MV的分子变异及其与寄主互作,不仅能够深入了解该病毒的分子进化机制,而且丰富对病毒与寄主互作机理的理解,深化对病毒致病机理与寄主抗病机制的了解,为抗病种质资源的选育提供理论依据。本研究获得了3个Tu MV分离物的全基因组序列及18个Tu MV分离物的cp基因序列,并对其进行了序列分析;以Tu MV basal-BR组分离物LWLB全基因组序列为基础构建Tu MV侵染性克隆;通过定点突变策略,分析P3蛋白在病毒与寄主互作中的功能。本研究主要结果分为四部分:(1)吉林长春、山东莱芜、山东潍坊三地采集到具有典型花叶症状的Tu MV病毒样品,单斑分离纯化后提取病毒粒子,分段扩增测序获得Tu MV的三个分离物的全基因组序列,分别命名为CCLB、LWLB、WFLB14,三个分离物全基因组均由9833个核苷酸组成,同源性为99.2-99.5%。系统进化树分析表明,包括本研究在内的33个Tu MV分离物形成basal-B、basal-BR、Asian-BR、world-B、OMs五个组,三个Tu MV分离物均属于basal-BR组。RDP 4软件重组分析发现,三个分离物没有发生明显的重组事件。选择压力分析发现,p3承受选择压力绝大部分来源于P3N-PIPO所产生的选择压力。使用MEGA 6.06软件对basal-BR组进行组内遗传距离分析,结果表明,获得的3个Tu MV分离物组内遗传距离为0.080±0.001。本研究还进行了cp基因的分子变异规律分析,将包括本研究得到的18个Tu MV分离物在内的48个该病毒分离物的cp基因序列构建系统进化树,结果显示,在18个Tu MV分离物中,除CCJSL10、GRJCJ09、RRJCJ09及CCJCJ09位于world-B组外,其余14个分离物均位于basal-BR组,且18个Tu MV分离物cp基因编码区均没有重组现象发生。(2)选取山东莱芜Tu MV分离物LWLB,构建侵染性克隆c DNA。主要内容包括:(1)内含子插入位点的选定,为避免基因重组,我们分析并选取了3个内含子插入位点,分别位于P3的C端、CI的N端及C端;(2)5’-UTR基因序列与35S启动子基因序列采用融合PCR的方法,融合两段基因序列;(3)Tu MV LWLB分离物全基因组序列分段连接双元载体p Cambia0390,并通过PCR、酶切及测序的方法验证全基因组已经成功连入p Cambia0390载体。遗憾的是,将构建的侵染性克隆c DNA转化进入农杆菌EHA105,浸润侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana),没有出现感病症状,初步判断该侵染性克隆没有侵染活性。(3)本课题组前期已证明,P3蛋白与拟南芥At SWEET1蛋白互作,在此基础上,通过双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation,Bi FC)验证其在本氏烟中的互作。同时,为了证明P3蛋白是否与拟南芥中除At SWEET1之外其他16个SWEET家族成员互作,通过酵母双杂交方法初步证明P3蛋白与拟南芥At SWEET4、At SWEET15蛋白之间存在互作。(4)根据现有报道,P3蛋白可能在病毒复制、决定致病性、症状形成、寄主抗性、病毒移动等方面具有重要功能。为了明确P3蛋白与Tu MV互作的重要氨基酸,进而进一步解析P3蛋白在病毒与寄主互作中的作用机制。本研究分别针对位于P3蛋白的62、67、123、188、299、300位的6个氨基酸位点及终止p3基因表达的p3基因的530位碱基和终止PIPO基因表达的p3基因的555位碱基等8个氨基酸位点,构建诱饵载体突变体,结果显示,除299位氨基酸突变后不与拟南芥At SWEET1蛋白互作外,其余7个位点突变后的P3蛋白均与At SWEET1蛋白存在互作,推测P3蛋白299位氨基酸可能是参与病毒与寄主互作的关键氨基酸。

关键词：芜菁花叶病毒分子变异侵染性克隆 P3 SWEET 蛋白互作

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