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赤羽病病毒N蛋白原核表达及单克隆抗体的制备

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生物工程学报 2024年第5期40卷 1548-1558页

作者：林永玉石正旺罗俊聪朱昱茜席韬周静张帆石鑫泰王川田宏甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enz... 详细信息

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞。经3次亚克隆筛选得到两株特异性针对AKAV N蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2C9与5E9。通过ELISA、免疫印迹(Western blotting)、间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)对其进行鉴定。结果显示,成功筛选到特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体。IFA发现其与AKAV N蛋白具有良好的反应性,亚型鉴定试剂盒鉴定2C9 mAb重链为IgG2b型,轻链为κ链;5E9 mAb重链为IgG1型,轻链为κ链;ELISA检测效价均为1:4 096 000。本研究成功制备了两株特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体,为赤羽病诊断方法的开发、疾病的防控以及AKAV N蛋白功能的研究奠定了基础。

关键词：赤羽病病毒 N蛋白原核表达单克隆抗体

非洲猪瘟病毒p30蛋白与CRM197的融合表达及对小鼠的免疫原性评价

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畜牧兽医学报 2024年

作者：张琦董宁宁谈晓梅石正旺李娜朱雯琪汤傲星李传锋朱杰刘光清苏艳孟春春新疆农业大学中国农业科学院上海兽医研究所中国农业科学院兰州兽医研究所

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、高传染性和致命的传染病，对猪养殖业造成了巨大的影响。安全有效的疫苗和有效治疗药物的缺乏给非洲猪瘟防控带来了巨大的挑战。作者尝试设计一种融合蛋白以改善非洲猪瘟病毒p30的免疫原性。... 详细信息

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、高传染性和致命的传染病，对猪养殖业造成了巨大的影响。安全有效的疫苗和有效治疗药物的缺乏给非洲猪瘟防控带来了巨大的挑战。作者尝试设计一种融合蛋白以改善非洲猪瘟病毒p30的免疫原性。白喉毒素的无毒突变体CRM197已被成功的用作多糖-蛋白结合疫苗的载体蛋白，以增强多糖的免疫原性。本研究构建p30与CRM197催化结构域（A片段）的融合表达质粒，纯化后的重组蛋白和单独p30分别使用小鼠评价了其免疫原性。结果显示：通过原核表达和亲和层析纯化得到融合蛋白p30-CRM197(A)免疫小鼠后，较单独表达的p30其可以在更短的时间内激发起高水平针对p30的特异性IgG，并且在初次免疫后56 d后还能维持较高水平的淋巴细胞免疫活力。本研究结果表明，CRM197的A片段作为载体蛋白显著增强原核表达p30蛋白的免疫原性，其可作为非洲猪瘟亚单位疫苗的候选分子内佐剂。

关键词：非洲猪瘟 CRM197 p30 免疫原性

猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA检测方法的建立和初步应用

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中国兽医科学 2024年第10期54卷 1302-1308页

作者：王婉莹石正旺罗俊聪廖焕程冯露郑海学田宏蔺国珍西北民族大学生命科学与工程学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

为检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）Ig A抗体，以PEDV重组S蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的小鼠抗猪Ig A单克隆抗体为检测抗体，建立并优化了PEDV Ig A抗体的ELISA检测方法，并评估了其特异性、敏感性、重复性及临床样品检测性能... 详细信息

为检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）Ig A抗体，以PEDV重组S蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的小鼠抗猪Ig A单克隆抗体为检测抗体，建立并优化了PEDV Ig A抗体的ELISA检测方法，并评估了其特异性、敏感性、重复性及临床样品检测性能。结果显示：该方法抗原最佳包被质量浓度为2μg/m L，酶标抗体的最佳工作浓度为1:25 000，血清最佳稀释度为1:50；与猪伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、塞内卡病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应；灵敏度为1:800；批内、批间变异系数均小于10%；与IDEXX商品化试剂盒的检测结果具有高度一致性。结果证明，本研究中建立的PEDV Ig A抗体检测方法特异性强、敏感性高、重复性好，适用于猪流行性腹泻的临床诊断与防控、流行病学调查以及免疫效果评估。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S蛋白 IgA抗体 ELISA

非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达

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中国兽医科学 2024年第1期54卷 1-11页

作者：唐静马旭升石正旺代军飞叶得河王萌马永华郑海学甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

探索非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)调控细胞因子产生和细胞死亡的机制。利用NLRP3炎症小体表达系统,筛选发现ASFV-C84L蛋白诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌上调。首先,利用生物信息学分析C84L的结构信息,通过实时... 详细信息

探索非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)调控细胞因子产生和细胞死亡的机制。利用NLRP3炎症小体表达系统,筛选发现ASFV-C84L蛋白诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌上调。首先,利用生物信息学分析C84L的结构信息,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)确定C84L蛋白在ASFV感染后的表达时序,细胞内定位;同时,用荧光素酶活性检测和蛋白免疫印迹(Western-blot)确定C84L蛋白参与调控p65的磷酸化以及IL-1β的成熟和细胞焦亡;然后,用碘化丙啶(PI)染色观察C84L蛋白诱导细胞的死亡情况;最后,使用qPCR和酶联免疫吸附试验检测C84L蛋白对IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子转录和分泌的影响。结果显示:C84L为亲水性蛋白,与沙门菌效应蛋白Sif A具有同源性;ASFV感染原代猪肺泡巨噬细胞4 h后,C84L m RNA表达水平逐渐上调,后续持续表达,第8小时达到顶峰;而且IFA结果显示,C84L蛋白在细胞质和细胞核中均有定位。荧光素酶和Western-blot结果显示,C84L促进p65的磷酸化并激活NF-κB启动子的活化。PI染色结果显示,C84L真核质粒转染细胞后诱导细胞死亡,Western-blot结果也显示C84L诱导Caspase-1成熟以及膜孔蛋白N-GSDMD (GSDMD剪切后的N端片段)剪切。将C84L真核质粒转染细胞后,IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子转录水平呈剂量依赖性升高;与转录水平相似,C84L表达诱导IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平上调。结论:ASFV C84L蛋白通过激活NF-κB以及NLRP3炎症小体诱导IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子表达水平上调以及细胞焦亡的发生。

关键词：非洲猪瘟病毒细胞因子 C84L NF-κB NLRP3

南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白单抗的制备与特性研究

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病毒学报 2024年第4期40卷 794-801页

作者：朱昱茜石正旺罗俊聪陈婕林永玉席韬张帆石鑫泰郑海学包世俊田宏甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730000

为制备南非2型口蹄疫病毒型特异性单克隆抗体,本研究通过原核系统表达南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白,亲和层析的方法纯化目的蛋白。将纯化的VP1蛋白使用弗氏佐剂乳化后,免疫BALB/c小鼠,待加强免疫后取血清效价最稳定的小鼠脾细胞与小鼠骨髓... 详细信息

为制备南非2型口蹄疫病毒型特异性单克隆抗体,本研究通过原核系统表达南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白,亲和层析的方法纯化目的蛋白。将纯化的VP1蛋白使用弗氏佐剂乳化后,免疫BALB/c小鼠,待加强免疫后取血清效价最稳定的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,应用间接ELISA筛选针对南非2型VP1蛋白的单克隆抗体。采用特异性试验、叠加试验和抗体亚型鉴定等方法对筛选的单克隆抗体特性进行分析。结果发现,本研究成功表达南非2型VP1蛋白,筛选出2株能稳定分泌特异性针对南非2型VP1蛋白的杂交瘤细胞株(3B2和6F2),其亚型分别为IgG2a和IgG1,叠加试验结果表明2株单抗的叠加系数>40%,说明两株单抗针对不同的抗原位点;单抗的效价可达1∶256000,特异性试验证明2株单抗均不与O型、A型口蹄疫病毒及其他常见猪病病毒产生交叉反应。由此可见,本研究制备的单克隆抗体具有良好的特异性和反应性,为南非2型口蹄疫病毒定型诊断和未来疫苗的研制奠定了基础。

关键词：南非2型口蹄疫病毒 VP1蛋白特异性单克隆抗体

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基于酶促重组酶扩增的非洲猪瘟病毒检测方法

畜牧兽医学报 2024年第9期55卷 4226-4231页

作者：冯露田宏郑海学石正旺罗俊聪张晓阳尉娟娟周静廖焕程王婉莹西北民族大学生命科学与工程学院兰州730000 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000

建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件... 详细信息

建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。结果显示:建立的ERA检测ASFV方法特异性强与其它病原无交叉反应;CV均小于10%,具有良好的重复性;对阳性样品拷贝数的检测下限为85 copies·μL^(-1);与世界动物卫生组织(WOAH)非洲猪瘟qPCR诊断方法对比,Kappa值为0.961,具有高度一致性。本研究建立的基于ERA检测ASFV方法可以用于ASFV的现场快速检测。

关键词：非洲猪瘟病毒 ERA 核酸检测等温扩增

O型FMD固相竞争ELISA及双抗夹心ELISA方法的建立与应用

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O型FMD固相竞争ELISA及双抗夹心ELISA方法的建立与应用

作者：石正旺甘肃农业大学

学位级别：硕士

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是引起偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病,严重影响世界畜牧业的发展。发达国家防控FMD主要是捕杀感染动物,我国对FMD的防控措施主要是疫苗免疫,FMD的快速诊断对FMD的防控至关重要。为了能快... 详细信息

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是引起偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病,严重影响世界畜牧业的发展。发达国家防控FMD主要是捕杀感染动物,我国对FMD的防控措施主要是疫苗免疫,FMD的快速诊断对FMD的防控至关重要。为了能快速特异性诊断FMD,本研究制备到O型FMDV的单克隆抗体,通过大量制备腹水,并将抗体纯化和标记HRP,命名为2B5-HRP。应用2B5-HRP建立固相竞争ELISA(SPCE)检测方法,结果表明,成功制备到针对O型FMDV的特异性单抗,SPCE检测血清的最佳稀释度为1:8,PI=40为反应的临界值。敏感性和特异性是评价诊断方法的重要指标,用180份FMD阳性血清检测SPCE的敏感性,其中176份为阳性,敏感性为97.8%。特异性试验检测273份FMD阴性血清,其中268份为阴性,特异性为98.2%。SPCE与LPB-ELISA、VDPro及PrioCHECK的符合率均高于95%。批内和批间重复试验良好,SPCE和LPB-ELISA检测免疫动物抗体水平基本相符。本试验建立的SPCE方法的敏感性和特异性较好,能特异性诊断O型FMD,可用于FMD的规模化检测,为FMD的流行病学调查提供了新的手段。为了建立快速特异性检测O型FMDV方法,本研究以O型兔抗为包被抗原,以单抗2B5-HRP的检测抗体建立了双抗夹心ELISA检测方法。特异性结果显示,建立的ELISA方法与猪水疱病病毒、A型和Asia-I型FMDV均无交叉性反应。敏感性结果与rRT-PCR检测结果相符,批内和批间重复性好。本试验建立的双抗夹心ELISA检测方法可用O型FMDV的检测,为FMDV的流行病学调查和控制提供了技术手段。

关键词：单克隆抗体固相竞争ELISA 双抗夹心ELISA 特异性敏感性

Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国兽医科学 2015年第12期45卷 1225-1230页

作者：刘华南杨帆杨华吕律曹伟军石正旺岳城郑海学才学鹏新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

为了获得Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体,以含Asia1型FMDV/JS/05毒株3B基因的pCAGGS-3B质粒为模板,扩增3B蛋白基因,并克隆至pET-30a（＋）载体,进行原核表达及纯化。分别以Asia1型口蹄疫病毒、纯化的3B蛋白为抗原,免疫4~6... 详细信息

为了获得Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体,以含Asia1型FMDV/JS/05毒株3B基因的pCAGGS-3B质粒为模板,扩增3B蛋白基因,并克隆至pET-30a（＋）载体,进行原核表达及纯化。分别以Asia1型口蹄疫病毒、纯化的3B蛋白为抗原,免疫4~6周龄的雌性BALB/c小鼠,经过4次免疫后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5∶1~10∶1进行细胞融合,用本实验室建立的间接ELISA对融合后的细胞进行筛选,并进行4次有限稀释筛选出的阳性细胞扩大培养后,注射小鼠腹腔,制备腹水。对制备的腹水进行类别鉴定、反应原性和效价鉴定。结果表明,获得1株能稳定分泌抗Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白的细胞株,其抗体类别为IgM,腹水效价为1∶12 800,通过Western-blot和间接免疫荧光试验,确定其能识别口蹄疫病毒3B蛋白。

关键词：口蹄疫病毒 3B蛋白单克隆抗体

羊口疮病毒B2L基因的原核表达、纯化及反应原性分析

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甘肃农业大学学报 2016年第6期51卷 1-5,10页

作者：石正旺刘华南胡永浩郑海学甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

【目的】克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性.【方法】根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片段连... 详细信息

【目的】克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性.【方法】根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片段连接至原核表达载体pET-30a(+)上,获得重组质粒pET-30a(+)-B2L.将此重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取单克隆进行扩大培养,经IPTG诱导获得重组融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting对表达的目的蛋白进行分析.【结果】成功获得重组质粒pET-30a(+)-B2L,读码框正确.获得了43ku的表达产物,与预期目的蛋白大小相符;纯化后的目的蛋白能与ORFV阳性血清发生特异反应.【结论】成功对ORFV-B2L蛋白进行了原核表达,且纯化后蛋白具有良好的反应原性.

关键词：羊口疮病毒 B2L基因原核表达纯化反应原性分析