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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 258-270页

作者：宋雯妍张瀚文吴澳迪张丽燕刘照叶桐桐陈创夫盛金良石河子大学动物科学院石河子832000

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组... 详细信息

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc^(-1)45细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRRSV-GP5蛋白进行原核表达并纯化,得到浓度为2.16 mg·mL^(-1)的重组蛋白,对羊驼三次免疫14 d后,其体内抗体效价高达1∶819200,构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库,库容量达2.93×107 CFU·mL^(-1),插入率为98%。经对噬菌体抗体文库连续三轮淘选富集后,最终获得2株不同氨基酸序列的纳米抗体。间接ELISA结果显示,2株纳米抗体均与PRRSV-GP5蛋白具有良好的亲和力。将2株纳米抗体转染至Marc^(-1)45细胞内,它们分别于36与60 h时显著阻碍PRRSV的复制与转录,展现出了较好的阻碍病毒复制的能力。本研究首次筛选出针对PRRSV-GP5蛋白的特异性纳米抗体,且经验证所筛纳米抗体具备抑制PRRSV在细胞内复制的能力,研究结果为抗PRRSV新型药物的研发奠定了试验依据与物质基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白纳米抗体噬菌体展示技术病毒复制

1株进口胎牛血清源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及小鼠致病性分析

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中国畜牧兽医 2024年 4052-4059页

作者：刘照董倩倩吴澳迪王凯月梁成哲 Adnan Ali 盛金良石河子大学动物科技学院

【目的】对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）进行分离鉴定和遗传进化分析。【方法】通过RT-PCR方法检测到实验室购买的某进口胎牛血清中存在BVDV核酸污染,将污染血清接种MDBK细胞,传代培养至第7代... 详细信息

【目的】对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）进行分离鉴定和遗传进化分析。【方法】通过RT-PCR方法检测到实验室购买的某进口胎牛血清中存在BVDV核酸污染,将污染血清接种MDBK细胞,传代培养至第7代,对每一代细胞的培养物进行BVDV 5′-UTR扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T载体并测序,对测序结果进行遗传进化分析;利用间接免疫荧光试验（IFA）进行分离株抗原检测和病毒滴度测定;将分离株接种BALB/c小鼠,采集眼眶血进行血常规检测和RT-PCR检测。【结果】该病毒分离株在培养MDBK细胞时未能引起细胞病变效应,细胞培养物RT-PCR扩增为阳性;基于5′-UTR序列的相似性分析表明,该分离株与BVDV UDEC-COY7-17（OL860952.1）毒株5′-UTR序列相似性为99.6%,同属BVDV-1e亚型;IFA检测到感染分离株的MDBK细胞细胞质中出现特异性绿色荧光信号,而对照组无信号;半数培养感染剂量(50%tissue culture infectivedose,TCID50)为10-4.7/0.1 mL;接种BALB/c小鼠后第7天血常规检测其血液中白细胞（WBC）和淋巴细胞（LYM）数量极显著低于对照组（P<0.01）。提取血液总RNA进行5′-UTR RT-PCR检测,检测结果为阳性,扩增产物大小为298 bp,与预期相符。【结论】本研究在进口胎牛血清中分离得到1株非致细胞病变型BVDV-1e亚型毒株,证明进口胎牛血清中存在BVDV抗原污染,为进一步研究BVDV的相关分子机制提供试验材料。

关键词：牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 胎牛血清分离鉴定致病性

一株牛源溶酪巨型球菌致病性及全基因组特征分析

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石河子大学学报（自然科学版） 2024年第4期42卷 438-448页

作者：薛嘉熹范文雨曹鑫艳高之煜顾兰英张秦川李世义盛金良孙延鸣张彦兵石河子大学动物科技学院新疆石河子832003

目的本研究旨在研究1株牛源溶酪巨型球菌(Macrococcus caseolyticus,***)的致病性和全基因组特征,挖掘该菌株的毒力和耐药相关基因。方法在新疆石河子市某牛场中采集1例病死牛肺脏,从牛肺脏灌洗液中分离鉴定了1株牛源溶酪巨型球菌,在此... 详细信息

目的本研究旨在研究1株牛源溶酪巨型球菌(Macrococcus caseolyticus,***)的致病性和全基因组特征,挖掘该菌株的毒力和耐药相关基因。方法在新疆石河子市某牛场中采集1例病死牛肺脏,从牛肺脏灌洗液中分离鉴定了1株牛源溶酪巨型球菌,在此基础上进行了药敏试验、动物感染试验;并通过Illumina的二代测序技术对该菌株进行全基因组框架图构建,构建多个管家基因同源进化树,对编码基因、重复序列、非编码RNA等进行预测,并在GO、KEGG、COG、NR和CAZy数据库对基因组的基本功能特征进行注释,结合NR数据库的注释和PHI、CARD数据库注释,明确其基因组中毒力因子、耐药性等相关基因。结果从牛肺中成功分离到一株***,通过感染兔子试验证实该菌株具有较强的致病性,病理切片结果显示兔子肺泡数量减少,大量炎性细胞渗出,肺泡囊增大,肺泡囊中充满渗出物,红细胞渗出,细支气管管壁塌陷。该菌经平均核苷酸相似度分类和系统发育树确定为溶酪巨型球菌,全基因组大小为2209314 bp,CG%含量为37.22%,平均长度为855 bp,编码2304个基因;其中tRNA有58个、rRNA有8个、sRNA有1个;含有3条CRISPRs序列。在GO数据库中有1028个基因得到注释,分别注释到分子功能、细胞组分和生物过程3大类;在KEGG数据库中共有1420个编码基因得到注释;在COG数据库中,共注释有23种功能的1961个基因;同时,在全基因组测序结果中发现51个毒力因子和对氨基糖苷类、β-内酰胺类和多肽类等抗生素的多种耐药基因,药物敏感性试验中菌株对测试的12类抗生素仅对磺胺类(复方新诺明)、林可霉素类(林可霉素)、青霉素类(氨苄西林)耐药。结论本研究从病死牛肺脏中分离得到1株牛源溶酪巨型球菌并命名为SHZXbov7,该菌具有较强的致病性,含有多种毒力因子和耐药基因,菌株SHZXbov7的基因组测序和注释将丰富溶酪巨型球菌的基因数据库,为溶酪巨型球菌相关疾病的防控提供参考。

关键词：溶酪巨型球菌耐药基因毒力基因基因组草图测序

口蹄疫和小反刍兽疫联合免疫技术研究与示范应用

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畜牧兽医科技信息 2024年第5期 93-96页

作者：何彦江盛金良蒋松易继海柴梦琦吴澳迪陈丹刘永强孙若芸常雪克拉玛依区动物卫生监督所新疆克拉玛依834000 石河子大学动物科技学院新疆石河子832000

为评估羊口蹄疫和小反刍兽疫联合免疫效果,对单独免疫和联合免疫对比研究,将102只羊分成单独免疫O型-A型口蹄疫组、单独免疫小反刍兽疫组、联合免疫O型-A型口蹄疫和小反刍兽疫组,免疫后观察羊的应激反应,免疫后28 d采血检测抗体水平。... 详细信息

为评估羊口蹄疫和小反刍兽疫联合免疫效果,对单独免疫和联合免疫对比研究,将102只羊分成单独免疫O型-A型口蹄疫组、单独免疫小反刍兽疫组、联合免疫O型-A型口蹄疫和小反刍兽疫组,免疫后观察羊的应激反应,免疫后28 d采血检测抗体水平。结果显示,单独免疫组口蹄疫O型、口蹄疫A型和小反刍兽疫抗体合格率分别为88.2%、85.3%、88.2%,联合免疫组口蹄疫O型、口蹄疫A型和小反刍兽疫抗体合格率分别为94.1%、91.1%、91.2%,联合免疫效果优于单独免疫效果,具有安全性。为进一步验证联合免疫效果,随机选择1468只羊联合免疫O型-A型口蹄疫和小反刍兽疫。检测结果显示,O型口蹄疫、A型口蹄疫以及小反刍兽疫免疫抗体合格率均≥70%,达到农业农村部要求。结果表明,联合免疫效果优于单独免疫效果,能够降低单独多次免疫造成的应激反应风险,而且可以降低劳动强度,减少防疫成本。

关键词：羊口蹄疫小反刍兽疫单独免疫联合免疫抗体检测分析评价

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绵羊清道夫受体A基因启动子克隆及序列分析

黑龙江畜牧兽医 2024年第4期 49-53页

作者：曹鑫艳魏立翔高之煜刘良波张辉闫卫疆肖非孙雪梅盛金良孙延鸣张彦兵石河子大学动物科技学院新疆石河子832003 新疆泰昆集团股份有限公司新疆昌吉831203

为了分析绵羊清道夫受体A(scavenger receptor A,SRA)基因的启动子序列特征,试验根据UCSC数据库和NCBI数据库预测的绵羊SRA基因启动子序列设计特异性引物,以绵羊肺组织基因组DNA为模板进行SRA基因启动子序列PCR扩增、测序,然后对序列进... 详细信息

为了分析绵羊清道夫受体A(scavenger receptor A,SRA)基因的启动子序列特征,试验根据UCSC数据库和NCBI数据库预测的绵羊SRA基因启动子序列设计特异性引物,以绵羊肺组织基因组DNA为模板进行SRA基因启动子序列PCR扩增、测序,然后对序列进行生物信息学分析,包括预测启动子活性区域、转录因子结合位点、TATA box及CpG岛。结果表明:利用根据UCSC数据库预测的SRA基因启动子序列设计的引物未扩增出目的片段,利用NCBI数据库预测的SRA基因启动子序列设计的引物扩增得到了绵羊SRA基因启动子序列,大小约为1200 bp,与NCBI预测序列的相似性为99%,其中第577位碱基发生了突变(G→A);含有1个潜在活性区域(aaaaatgagctcacattcattttttttttcttaactggc);存在干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)1、IRF2、c-Jun、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein,C/EBP)、活化蛋白1(activator protein 1,AP-1)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)转录因子结合位点,其中IRF1和c-Jun的结合位点出现频率较高;不存在TATA box和CpG岛,只存在3个CpG位点。说明SRA基因的表达可能受IRF1和c-Jun等相关转录因子的调控,不受甲基化的影响。

关键词：清道夫受体A 启动子生物信息学分析启动子活性区域转录因子 CpG岛

靶向严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2的人工microRNAs设计与思考

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畜牧兽医科技信息 2024年第4期 59-62页

作者：高之煜曹鑫艳顾兰英范文雨张镱娴杜非凡曹继睿蒋松盛金良孙延鸣张彦兵石河子大学动物科技学院新疆石河子832003 新疆泰昆集团股份有限公司新疆昌吉831203

动植物人工miRNAs(artificial miRNAs,amiRNAs)在抗病毒感染中发挥重要作用。然而,有关amiRNAs靶向抑制重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的相关研究未见报道。目的:本研究旨在设计靶向SARS-CoV-2的amiRNAs,进一步分析amiRNAs对不同变异株的匹配程度。方法:利用Invitrogen Block-iT RNAi Designer成功设计靶向SARS-CoV-2的amiRNAs。结果:分别命名为amiR-Cov23utr-1、2、3、4;其中amiR-Cov23utr-1、3和4在Omicron BA.5/2022中靶向区域序列十分保守;amiR-Cov23utr-2在Omicron BA.5/2022中的靶点缺失。结论:本研初步设计和分析了靶向SARS-CoV-2的amiRNAs,为后续深入研究amiRNAs抗SARS-CoV-2感染提供了重要基础资料。

关键词：重症急性呼吸综合征冠状病毒2 靶向人工microRNAs 抗病毒 3′非翻译区

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污泥膜覆盖好氧发酵通风调节方法

环境工程学报 2013年第2期7卷 705-710页

作者：盛金良龚莹宫宁施炜同济大学机械与能源工程学院上海200092

建立了污泥膜覆盖好氧发酵通风实验装置。结合污泥不同发酵阶段通风量的需求,分别通过风机入口节流调节和变频调节实现实验堆体系统通风量的改变,测取了相应的堆体风压和风机功率;结果表明,2种调节方式均适用于膜覆盖好氧发酵工艺,但变... 详细信息

建立了污泥膜覆盖好氧发酵通风实验装置。结合污泥不同发酵阶段通风量的需求,分别通过风机入口节流调节和变频调节实现实验堆体系统通风量的改变,测取了相应的堆体风压和风机功率;结果表明,2种调节方式均适用于膜覆盖好氧发酵工艺,但变频调节在调节性能上优于节流调节。而且,变频调节的风机能耗远小于节流调节,在小风量通风时相差可达5～6倍。由于功能膜的作用,变频调节的通风量近似为频率的二次函数而非理论上的线性关系。

关键词：污泥好氧发酵膜覆盖工艺通风调节方法