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牡蛎疱疹病毒结构蛋白真核表达系统构建及多聚化特性

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水产学报 2024年第5期48卷 65-74页

作者：曹书华魏茂乐李永仁黄博闻辛鲁生白昌明王崇明天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡，成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用人胚胎肾细胞(HEK293t)，构建OsHV-1主要核衣壳蛋白(ORF104和ORF33)的真核表达系统，... 详细信息

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡，成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用人胚胎肾细胞(HEK293t)，构建OsHV-1主要核衣壳蛋白(ORF104和ORF33)的真核表达系统，并对ORF104和ORF33潜在相互作用进行分析。实验首先通过特异性PCR扩增技术得到orf 104和orf 33的基因序列，根据其编码蛋白的理化性质、跨膜区与三维结构等生物信息学分析结果，选择pCDNA3.1(+)构建两种基因的重组表达质粒。重组质粒经大肠杆菌扩增、提取后，利用转染试剂Lipo8000?将pCDNA3.1(+)-orf 104与pCDNA3.1(+)-orf 33分别单独或共转染至HEK293t。然后，将转染后的细胞培养18 h后裂解收集蛋白。最后利用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)与负染电镜检测两种目的蛋白的表达情况。结果显示，实验成功构建了OsHV-1衣壳蛋白ORF104和ORF33的重组表达质粒载体，通过真核细胞表达得到大小约为135与35 ku的目的蛋白。研究表明，表达质粒可在真核表达系统中实现蛋白单独转染与共转染，共转染蛋白间可能存在相互作用的趋势并形成多聚体，其中，ORF33自身即可形成分子质量不同的多聚体。本研究首次利用真核表达系统开展OsHV-1关键结构蛋白的表达，为进一步开展该病毒结构蛋白功能与互作，以及病毒入侵机制研究奠定基础。

关键词：牡蛎疱疹病毒核衣壳蛋白真核表达系统蛋白多聚化

养殖环境及贝源溶藻弧菌MLST分型及其毒力基因、耐药性分析

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渔业科学进展 2024年第1期45卷 211-223页

作者：郑玉东张翔姚梦丽谷莉黄博闻辛鲁生白昌明王崇明唐小千中国海洋大学水产动物病害与免疫学实验室山东青岛266003 中国水产科学研究院黄海水产研究所海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室山东青岛266071

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一,对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁。本研究旨在分析不同养殖环境水体和贝类组织中,溶藻弧菌的基因变异、毒力基因、耐药性及其分布规律。对12株溶藻弧菌... 详细信息

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一,对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁。本研究旨在分析不同养殖环境水体和贝类组织中,溶藻弧菌的基因变异、毒力基因、耐药性及其分布规律。对12株溶藻弧菌分离株开展多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、毒力因子以及菌株耐药性分析,结果显示,12株溶藻弧菌的序列型(sequence typing,ST)分型互不相同,7株为Pub MLST数据库已经收录的ST型,5株因管家基因的等位基因位点变化而形成新的ST型,贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有较高的遗传多样性。12株溶藻弧菌都携带tlh、fur和collagenase三种毒力基因,但均未检测到tdh、trh、toxR和tcpA毒力基因。溶藻弧菌携带毒力因子的种类和数量受地区分布等因素的影响。不同来源的溶藻弧菌均具有多重耐药特征,对青霉素和氨苄西林产生抗性。本研究表明,贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有种群复杂、遗传多样性高的特点;不同来源菌株在毒力基因携带和耐药性方面存在较大差异。本研究通过探究不同区域内不同来源的溶藻弧菌遗传变异及耐药性差异,对贝源溶藻弧菌的有效防控提供一定理论参考。

关键词：溶藻弧菌 MLST 毒力基因耐药性分析

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小鼠和绵羊类胚胎干细胞的分离与培养

小鼠和绵羊类胚胎干细胞的分离与培养

作者：白昌明西北农林科技大学

学位级别：硕士

绵羊ES细胞（embryonic stem cells,ES细胞）是制备乳腺生物反应器的理想候选细胞,然而至今仍没有成功建系的报道。昆白小鼠是我国科研工作中最常用的实验动物之一,但已经建立的小鼠ES细胞系大多来源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠... 详细信息

绵羊ES细胞（embryonic stem cells,ES细胞）是制备乳腺生物反应器的理想候选细胞,然而至今仍没有成功建系的报道。昆白小鼠是我国科研工作中最常用的实验动物之一,但已经建立的小鼠ES细胞系大多来源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠,而用昆白小鼠建系的报道很少,因此建立绵羊和昆白小鼠类ES细胞系对我国深入而便利地开展ES细胞以及其他生命科学领域的研究具有重要意义。本研究选用体内来源的小尾寒羊和昆白小鼠胚胎为试验对象,参照已报道的小鼠和人ES细胞建系方法,系统比较了不同培养条件对分离培养昆白小鼠和不同胚胎发育时期来源的绵羊类ES细胞的影响。主要获得以下结论: 1.试验中共获得昆白小鼠胚胎120枚,其中有98枚顺利孵化,并形成内细胞团（ICM）,ICM贴孵化为81.7%;从形成的98枚ICM中得到类ES细胞,共有68个形成类ES细胞集落,ES的细胞集落贴壁率为56.7%。实验比较了分别使用KSR和FBS对昆白小鼠类ES细胞分离和传代培养的影响。结果表明,使用KSR可以促进昆白小鼠类ES细胞生长的影响情况,并把昆白小鼠类ES细胞传至18代,仍然保持多能性和正常二倍体核型。 2.比较了不同胎龄绵羊胚胎对绵羊类ES细胞分离、克隆的影响。与桑椹胚和孵化胚相比,尽管囊胚的贴壁率（80.0%）比孵化胚的贴壁率（87.5%）略低,差异不显著（p＞0.05）,但囊胚的ICM增殖率（66.7%）和传代效果明显优于孵化胚（50.0%）和桑椹胚（19.0%）。结果表明,囊胚更适合于绵羊类ES的分离、培养。 3.比较了不同饲养层对绵羊类ES细胞分离、克隆的影响。分别以小鼠胎儿成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast ,MEF）、绵羊胎儿成纤维细胞（Sheep embryonic fibroblast,SEF）为饲养层分离、培养绵羊类ES细胞。结果表明,胚胎在这2种饲养层上的孵化率（69.2%;56.3%）和ICM贴壁率（61.5%;43.8%）,差异不显著;但在MEF上生长的绵羊类ES细胞最高传至5代,而绵羊类ES细胞在SEF上仅传至2代,这一结果表明MEF更适合于绵羊ES细胞分离、培养。 4.以MEF为饲养层,分析血清替代品（Knockout serum replacement,KSR）和小鼠ES细胞条件培养基（Embryonic stem cell conditioned medium,ESCCM）单独或者联合应用对绵羊类ES细胞分离克隆效率的影响,发现绵羊类ES细胞在含相同体积分数FBS和KSR中分别传至3代和5代,而在含KSR和40%ESCCM条件培养基里,可最高传至8代。表明KSR和ESCCM单独或联合使用均能促进绵羊类ES细胞分离与克隆,但以KSR和ESCCM联合使用效果最佳。 5.对分离得到的绵羊和小鼠ES细胞进行碱性磷酸酶染色（AKP）活性、ES细胞特异性转录因子表达活性检测以及体外分化能力鉴定和核型分析,结果表明:所分离的绵羊和小鼠类ES细胞的AKP染色呈强阳性,并能分别表达特异性转录因子OCT-4和Nanog;体外可自发分化成神经样和上皮样细胞等,将ES细胞培养于无LIF的培养液中,得到了类胚体,说明所得到的绵羊和小鼠ES细胞具有ES细胞的典型特征;分别对其中的一株绵羊和小鼠类ES细胞进行核性分析,其核型均表现为正常的二倍体核型。

关键词：绵羊昆白小鼠 ES细胞小鼠ES细胞条件培养基 KSR

不同培养体系对绵羊类胚胎干细胞分离、传代的影响

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生物工程学报 2008年第7期24卷 1268-1273页

作者：白昌明刘丑生王志刚王新庄西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 农业部全国畜牧总站畜禽牧草种质资源保存利用中心北京100094 河南农业大学牧医工程学院郑州450002

以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,研究了用Knockout血清替代品(Knockout serum replacement,KSR)代替胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES cell)培养液中的胎牛血清(FBS)和向含KSR的基础培养液中添加40%的小鼠ES细胞条件培养液(ES cell conditioned medium,ESCCM)对绵羊类ES细胞分离、克隆效率的影响。发现使用含FBS的基础培养液最多可以把绵羊类ES细胞传至3代,而使用KSR和添加ESCCM能促进绵羊类ES细胞的分离和克隆,所获得的类ES细胞分别可稳定传至第5和8代。同时对类ES细胞进行核型分析、AKP染色及体外分化能力检测,证实所分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征。由此认为,与FBS相比KSR更加适于绵羊类ES细胞的分离与培养;而小鼠ES细胞在生长过程中可能分泌某些重要的细胞因子,从而达到促进绵羊ES细胞增值的作用。

关键词：绵羊类ES细胞小鼠ES细胞条件培养基 knockout血清替代品自我更新

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急性病毒性坏死病毒IAP-86基因的克隆、表达及抗凋亡研究

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水产学报 2014年第2期38卷 274-281页

作者：张帅王崇明宋晓玲白昌明黄倢中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室上海海洋大学水产与生命学院

在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒... 详细信息

在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒pET32a-IAP86,将重组质粒转化到*** BL21(DE3)中,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测显示表达蛋白分子量约为40 ku,经Western-blotting和质谱分析证明,该蛋白即为IAP-86融合蛋白,Co2+柱纯化后得到了纯化的IAP-86融合蛋白。将重组的IAP-86蛋白用FITC标记,荧光显微镜下观察,发现重组的IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合。细胞凋亡检测实验发现,重组的IAP-86蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡,凋亡抑制率为7%。本实验应用原核表达成功得到了IAP-86蛋白,并证明IAP-86对栉孔扇贝细胞的凋亡有一定抑制作用,这为进一步研究AVNV的侵染机制提供依据。

关键词：栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒杆状病毒凋亡抑制蛋白原核表达抗凋亡

基于长片段PCR扩增的牡蛎疱疹病毒基因组高通量测序

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水产学报 2018年第2期42卷 216-225页

作者：史杰白昌明李晨蔡生力王崇明上海海洋大学水产与生命学院中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室

为获取2001年低温冻存栉孔扇贝感染牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)变异株(ZK2001)基因组序列,并分析ZK2001与其他Os HV-1变异株的序列差异和系统发育关系,利用基于长片段PCR的基因组DNA的扩增和富集技术,获取2001年栉孔扇贝感染Os HV-1变异株的... 详细信息

为获取2001年低温冻存栉孔扇贝感染牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)变异株(ZK2001)基因组序列,并分析ZK2001与其他Os HV-1变异株的序列差异和系统发育关系,利用基于长片段PCR的基因组DNA的扩增和富集技术,获取2001年栉孔扇贝感染Os HV-1变异株的基因组DNA;再使用Illumina Hiseq 2500 PE250高通量测序平台对其测序。最后分析ZK2001与Os HV-1其他变异株基因组的序列差异和系统发育关系。测序数据组装后获得8个Scaffold。基因组变异分析结果显示,ZK2001与参考基因组相比存在328个SNP位点,SNP和序列插入/缺失变异是导致Os HV-1基因组序列变异的主要变异类型。系统发育分析结果显示,ZK2001变异株与分离自我国的Os HV-1变异株亲缘关系最近,与分离自欧洲的Os HV-1μvar及其相关变异株的亲缘关系最远,说明中国和欧洲分布Os HV-1间存在因地理隔离导致的遗传分化。研究表明,基于长片段PCR的DNA富集技术,可以有效地扩增和富集冷冻样本中Os HV-1基因组DNA,并应用于高通量测序。Os HV-1不同变异株基因组序列数据的获取和积累,将为其基因组尺度的基因变异、株系演化和系统发育关系等研究提供重要基础。

关键词：栉孔扇贝高通量测序长片段PCR 牡蛎疱疹病毒

基于牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因的巢式PCR检测方法的建立及应用

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水产学报 2016年第3期40卷 326-333页

作者：高文辉白昌明蔡生力王崇明上海海洋大学水产与生命学院中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室

为了建立适用于Os HV-1不同变异株的检测方法,在牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)3个变异株全基因组序列比对的基础上,筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的DNA聚合酶(DNA polymerase)基因,据此设计巢式PCR引物,优化PCR反应体系和条件,建立了基于... 详细信息

为了建立适用于Os HV-1不同变异株的检测方法,在牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)3个变异株全基因组序列比对的基础上,筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的DNA聚合酶(DNA polymerase)基因,据此设计巢式PCR引物,优化PCR反应体系和条件,建立了基于Os HV-1 DNA聚合酶基因的巢氏PCR检测方法(P-n PCR检测方法),利用P-n PCR与Cn PCR检测方法对不同年份和宿主来源的Os HV-1疑似感染样本进行检测。结果显示,Pn PCR检测方法能稳定地检出100拷贝/μL的病毒DNA;P-n PCR较C-n PCR检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明,本研究建立的P-n PCR检测方法适用于Os HV-1不同变异株的检测,可为该病毒的检测和流行病学调查提供可靠的技术支持。

关键词：牡蛎疱疹病毒巢式PCR 分子变异特异性

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软体动物疱疹病毒及其对贝类养殖产业的危害

渔业科学进展 2021年第1期42卷 214-226页

作者：白昌明辛鲁生王崇明中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室青岛266071

中国是贝类养殖大国,30余年来,贝类养殖产量总体稳中有升,但部分贝类的养殖产业因疫病影响出现严重萎缩、甚至消失。20世纪90年代以来,中国多种双壳贝类和杂色鲍(Haliotis diversicolor supertexta)因感染疱疹病毒出现大规模死亡,成为... 详细信息

中国是贝类养殖大国,30余年来,贝类养殖产量总体稳中有升,但部分贝类的养殖产业因疫病影响出现严重萎缩、甚至消失。20世纪90年代以来,中国多种双壳贝类和杂色鲍(Haliotis diversicolor supertexta)因感染疱疹病毒出现大规模死亡,成为近年来危害中国贝类养殖业的主要病原。经流行病学调查和病原鉴定,引起中国双壳贝类和杂色鲍死亡的疱疹病毒分别为牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)和鲍疱疹病毒(Haliotid herpesvirus 1,HaHV-1)。贝类疱疹病毒病不仅在中国发生,同时也在全球多个国家、地区传播和暴发,引起全球贝类养殖从业者和科研人员的广泛关注。多国学者从病毒特征、流行病学、诊断技术、生态防控和抗病育种等多个角度展开研究,以期减轻此类病毒对贝类产业造成的危害。大量科研力量的投入使OsHV-1和HaHV-1成为分类地位明确,研究最深入、最全面的贝类病毒性病原。本文对近年来OsHV-1和HaHV-1研究领域取得的主要成果进行总结,重点介绍其在中国和全球范围的发生、传播过程、产业危害和防控措施等。

关键词：贝类养殖软体动物疱疹病毒牡蛎疱疹病毒鲍疱疹病毒

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牡蛎疱疹病毒病防治技术

农业知识 2023年第4期 33-34页

作者：徐涛白昌明山东省渔业发展和资源养护总站济南250013 中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛266000

牡蛎疱疹病毒是第一个被鉴定出来可以感染无脊椎动物的疱疹病毒,根据疱疹病毒国际命名规则,缩写为OsHV-1。几十年来,在牡蛎、扇贝、蚶类等不同类群的双壳贝类中发现疱疹病毒感染引起的发病和死亡案例,经鉴定均是牡蛎疱疹病毒的不同变异... 详细信息

牡蛎疱疹病毒是第一个被鉴定出来可以感染无脊椎动物的疱疹病毒,根据疱疹病毒国际命名规则,缩写为OsHV-1。几十年来,在牡蛎、扇贝、蚶类等不同类群的双壳贝类中发现疱疹病毒感染引起的发病和死亡案例,经鉴定均是牡蛎疱疹病毒的不同变异株所致。为确保山东省贝类生产的安全,现将牡蛎疱疹病毒病防治技术措施总结如下。

关键词：疱疹病毒防治技术措施命名规则死亡案例双壳贝类牡蛎无脊椎动物变异株

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