小鼠和绵羊类胚胎干细胞的分离与培养

作     者：白昌明 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王新庄

授予年度：2008年

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：绵羊 昆白小鼠 ES细胞 小鼠ES细胞条件培养基 KSR 

摘      要：绵羊ES细胞（embryonic stem cells,ES细胞）是制备乳腺生物反应器的理想候选细胞,然而至今仍没有成功建系的报道。昆白小鼠是我国科研工作中最常用的实验动物之一,但已经建立的小鼠ES细胞系大多来源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠,而用昆白小鼠建系的报道很少,因此建立绵羊和昆白小鼠类ES细胞系对我国深入而便利地开展ES细胞以及其他生命科学领域的研究具有重要意义。本研究选用体内来源的小尾寒羊和昆白小鼠胚胎为试验对象,参照已报道的小鼠和人ES细胞建系方法,系统比较了不同培养条件对分离培养昆白小鼠和不同胚胎发育时期来源的绵羊类ES细胞的影响。主要获得以下结论: 1.试验中共获得昆白小鼠胚胎120枚,其中有98枚顺利孵化,并形成内细胞团（ICM）,ICM贴孵化为81.7%;从形成的98枚ICM中得到类ES细胞,共有68个形成类ES细胞集落,ES的细胞集落贴壁率为56.7%。实验比较了分别使用KSR和FBS对昆白小鼠类ES细胞分离和传代培养的影响。结果表明,使用KSR可以促进昆白小鼠类ES细胞生长的影响情况,并把昆白小鼠类ES细胞传至18代,仍然保持多能性和正常二倍体核型。 2.比较了不同胎龄绵羊胚胎对绵羊类ES细胞分离、克隆的影响。与桑椹胚和孵化胚相比,尽管囊胚的贴壁率（80.0%）比孵化胚的贴壁率（87.5%）略低,差异不显著（p0.05）,但囊胚的ICM增殖率（66.7%）和传代效果明显优于孵化胚（50.0%）和桑椹胚（19.0%）。结果表明,囊胚更适合于绵羊类ES的分离、培养。 3.比较了不同饲养层对绵羊类ES细胞分离、克隆的影响。分别以小鼠胎儿成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast ,MEF）、绵羊胎儿成纤维细胞（Sheep embryonic fibroblast,SEF）为饲养层分离、培养绵羊类ES细胞。结果表明,胚胎在这2种饲养层上的孵化率（69.2%;56.3%）和ICM贴壁率（61.5%;43.8%）,差异不显著;但在MEF上生长的绵羊类ES细胞最高传至5代,而绵羊类ES细胞在SEF上仅传至2代,这一结果表明MEF更适合于绵羊ES细胞分离、培养。 4.以MEF为饲养层,分析血清替代品（Knockout serum replacement,KSR）和小鼠ES细胞条件培养基（Embryonic stem cell conditioned medium,ESCCM）单独或者联合应用对绵羊类ES细胞分离克隆效率的影响,发现绵羊类ES细胞在含相同体积分数FBS和KSR中分别传至3代和5代,而在含KSR和40%ESCCM条件培养基里,可最高传至8代。表明KSR和ESCCM单独或联合使用均能促进绵羊类ES细胞分离与克隆,但以KSR和ESCCM联合使用效果最佳。 5.对分离得到的绵羊和小鼠ES细胞进行碱性磷酸酶染色（AKP）活性、ES细胞特异性转录因子表达活性检测以及体外分化能力鉴定和核型分析,结果表明:所分离的绵羊和小鼠类ES细胞的AKP染色呈强阳性,并能分别表达特异性转录因子OCT-4和Nanog;体外可自发分化成神经样和上皮样细胞等,将ES细胞培养于无LIF的培养液中,得到了类胚体,说明所得到的绵羊和小鼠ES细胞具有ES细胞的典型特征;分别对其中的一株绵羊和小鼠类ES细胞进行核性分析,其核型均表现为正常的二倍体核型。