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重组单链胰岛素的连接肽与其生物功能的关系

中国科学（C辑） 2001年第5期31卷 458-464页

作者：黄一丁梁镇和冯佑民中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

为研究重组单链胰岛素的生物活性与连接肽之间的关系, 用基因定点突变的方法分别以二肽A-K, 七肽A-A-A-A-A-A-K和十二肽A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-K连接胰岛素的B30和A1, 得到3个单链胰岛素分子PIP, [A]5PIP和[A]10PIP. 它们的受体结合能... 详细信息

为研究重组单链胰岛素的生物活性与连接肽之间的关系, 用基因定点突变的方法分别以二肽A-K, 七肽A-A-A-A-A-A-K和十二肽A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-K连接胰岛素的B30和A1, 得到3个单链胰岛素分子PIP, [A]5PIP和[A]10PIP. 它们的受体结合能力分别为胰岛素的0.14%, 14.3% 和11.1%, 体内生物活性与受体结合能力一致, 而它们的促生长活性分别为胰岛素的17%, 116.3%和38%. 结果表明: (ⅰ) 单链胰岛素也具有胰岛素的促代谢和促生长功能; (ⅱ) 单链胰岛素与胰岛素受体的结合能力与连接肽的长度和氨基酸组成密切相关, 其受体结合能力随连接肽的改变, 可由无到100%, 进一步说明胰岛素与其受体结合时, B链C端远离A链N端是必需的; (ⅲ) 单链胰岛素的促细胞生长能力也与连接肽长度和组成密切相关, 且比其自身的促代谢能力强.

关键词：单链胰岛素受体结合促细胞生长 GR2H6细胞株生物活性蛋白质激素连接肽

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胰岛素蛋白质工程：B9Glu，B10Asp人胰岛素

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1996年第5期 3-7页

作者：梁镇和刘滨唐月华冯佑民中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室

用缺口双链ＤＮＡ的定向突变方法分别将胰岛素Ｂ链第９和第１０位的Ｓｅｒ和Ｈｉｓ改变为Ｇｌｕ和Ａｓｐ，获得Ｂ９Ｇｌｕ，Ｂ１０Ａｓｐ〕人胰岛素。其受体结合能力为猪胰岛素的３４．４％，而体内活力与猪胰岛素基本相同。

关键词： (B9Glu,B10Asp)人胰岛素蛋白质工程速效胰岛素

大肠杆菌高效表达包函体蛋白N－Met的加工

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1994年第4期26卷 433-436页

作者：杨新颖梁镇和李伯良中国科学院上海生物化学研究所

大肠杆菌高效表达包函体蛋白Ｎ－Ｍｅｔ的加工杨新颖，梁镇和，李伯良（中国科学院上海生物化学研究所，２０００３１）关键词牛生长激素；高效表达；Ｎ－Ｍｅｔ氨肽酶基因工程已使许多外源基因或基因片段在大肠杆菌中实现了高效表达，... 详细信息

大肠杆菌高效表达包函体蛋白Ｎ－Ｍｅｔ的加工杨新颖，梁镇和，李伯良（中国科学院上海生物化学研究所，２０００３１）关键词牛生长激素；高效表达；Ｎ－Ｍｅｔ氨肽酶基因工程已使许多外源基因或基因片段在大肠杆菌中实现了高效表达，最高的表达蛋白质带可达全菌总蛋白质...

关键词：牛生长激素高效表达 N-Met氨肽酶

人胰岛素生长因子Ⅰ基因的人工合成、克隆及其表达

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1994年第2期 153-160页

作者：李伯良胡明杨新颖周彬梁镇和李其梁汤锦炎中国科学院上海生物化学研究所

采用固相亚磷酸三脂法，化学合成了人胰岛素样生长因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）结构基因的两个１２９聚体特长单链ＤＬＡ片段，通过其中的２３ｂｐ互补配对和ｋｌｅｎｏｗ酶酶促补齐成为ＩＧＦ－Ｉ基因的双链ＤＮＡ片段．，先克隆进ｐＵＣ１２... 详细信息

采用固相亚磷酸三脂法，化学合成了人胰岛素样生长因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）结构基因的两个１２９聚体特长单链ＤＬＡ片段，通过其中的２３ｂｐ互补配对和ｋｌｅｎｏｗ酶酶促补齐成为ＩＧＦ－Ｉ基因的双链ＤＮＡ片段．，先克隆进ｐＵＣ１２载体质技筛选阳性重组子，然后转插入Ｍ１３噬菌体中进行ＤＮＡ全序列测定分析及寡核苷酸引导的定向点突变校正，获得了人工合成的ＩＧＦ－Ｉ结构基因。进一步分别重组构建了在ＰＬａｃ和ＰＬＰｒｏｍｏｔｅ，控制下的人工合成ＩＧＦ－Ｉ基因表达质粒ＰＨＭ５９０和ｐＢＬＥ０１１，在大肠杆菌中进行了表达研究。经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ对表达全菌分析，都观察到明显的融合表达蛋白带，其中含ｐＢＬＥ０１１质粒表达菌的蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果表明温敏诱导表达产物可与特异性ＩＯＦ－Ｉ抗体反应。同时，从表达菌裂解液中均检测到很强的ＩＧＦ－Ｉ放射免疫结合活性。这些表明已成功地人工合成ＩＧＦ－Ｉ基因并在大肠杆菌中获得速效表达。

关键词：人工合成基因基因重组克隆表达人胰岛素样生长因子Ⅰ

人胰岛素在甲醇酵母Pichiapa storis中的分泌表达

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生物化学与生物物理学报 1999年第5期31卷 587-589页

作者：王燕梁镇和张友尚崔大敷冯佑民中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室中国科学院上海生物化学研究所!上海200031

将猪胰岛素前体（ＰＩＰ）基因和在其５′端引入９个氨基酸的间隔肽序列的ＰＩＰ基因（ｓｐ ＰＩＰ）插入到Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ的分泌表达质粒ｐＰＩＣ９中，得到分泌表达质粒ｐＰＩＣ９／ＰＩＰ... 详细信息

将猪胰岛素前体（ＰＩＰ）基因和在其５′端引入９个氨基酸的间隔肽序列的ＰＩＰ基因（ｓｐ ＰＩＰ）插入到Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ的分泌表达质粒ｐＰＩＣ９中，得到分泌表达质粒ｐＰＩＣ９／ＰＩＰ和ｐＰＩＣ９／ｓｐ ＰＩＰ并用以转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５。用点杂交筛选，获得高拷贝转化子Ｐ３９（ｓｐ）和Ｓ５１（＋ｓｐ）。经１Ｌ摇瓶培养，Ｐ３９和Ｓ５１在Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中分泌表达ＰＩＰ和ｓｐ ＰＩＰ的量分别为１０ｍｇ／Ｌ和４０ｍｇ／Ｌ。ｓｐ ＰＩＰ在Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中的表达水平高于其在本实验室报道的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ和Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中的表达，表明间隔肽的引入有助于提高ＰＩＰ的表达。用１０Ｌ罐发酵ｓｐ ＰＩＰ表达量达２５０ｍｇ／Ｌ。ＰＩＰ和ｓｐ ＰＩＰ经转肽得到重组人胰岛素，其受体结合能力与猪胰岛素相同，体内生物活力２７ＩＵ／ｍｇ。

关键词：重组人胰岛素猪胰岛素前体甲醇酵母Pichiapastoris 表达体系

牛生长激素释放因子的融合表达及其产物的化学加工

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1994年第6期26卷 577-583页

作者：李伯良胡明杨新颖梁镇和李其梁王德宝中国科学院上海生物化学研究所

通过寡核苷酸引导的定位突变，在人工全合成的第２７位为Ｉｌｅ的牛生长激素释放因子［Ｉｌｅ２７］ｂＧＢＦ（１～４４）ＯＨ基因的５’端ＡＴＧ后插入Ｔｒｐ密码子序列（ＴＧＧ），并分别构建了ＰＬｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下的、以β－... 详细信息

通过寡核苷酸引导的定位突变，在人工全合成的第２７位为Ｉｌｅ的牛生长激素释放因子［Ｉｌｅ２７］ｂＧＢＦ（１～４４）ＯＨ基因的５’端ＡＴＧ后插入Ｔｒｐ密码子序列（ＴＧＧ），并分别构建了ＰＬｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下的、以β－半乳糖苷酶（β－Ｇａｌ，３１０ａ．ａ．）和ｐｒｏｔｅｉｎＡ结合ＩｇＧｄｏｍａｉｎＢ．Ｃ（ＰＡＢＣ，１５０ａ．ａ．）为载体蛋白的融合型基因表达质ｐＢＬＥ３１０和ｐＢＬＰＡＥ２Ｄ，在大肠杆菌中得到高效表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，表达产物β－Ｇａｌ－ｂＧＲＦ和ＰＡＢＣ－ｂＧＲＦ分别可达全菌蛋白的２０％和３０％以上，其中ＰＡＢＣ－ｂＧＲＦ通过ＩｇＧ固相柱亲和层析，被快速分离纯化为均一条带，每升摇瓶菌可得到１００ｍｇ以上ＰＡＢＣ－ｂＧＲＦ融合蛋白。进而使用Ｔｒｐ氧化试剂成功地加工裂解了ＰＡＢＣ－ｂＧＲＦ融合蛋白；裂解率达５５％：裂解混合物经ＩｇＧ柱一步亲和层析，获得目的基因产物［Ｉｌｅ２７］ｂＧＲＦ（１～４４）ＯＨ；Ｎ端氨基酸序列分析表明产物Ｎ端１５个氨基酸顺序均与天然产物Ｎ端序列完全一致。

关键词： bGRF基因融合表达蛋白加工

牛生长激素基因的人工合成、重组克隆及高效表达

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1994年第5期26卷 505-512页

作者：李伯良梁镇和杨新颖干科达周彬李其樑汤锦炎中国科学院上海生物化学研究所

本文通过设计选择大肠杆菌高频利用密码子代替天然密码子，人工全合成３２个寡聚核苷酸片段；连接并克隆获得Ａ（２７８ｂｐ）、Ｂ（８８ｂｐ）、Ｃ（２２４ｂｐ）３个较大ＤＮＡ片段；经重组克隆、定位突变等获得阳性克隆；双向ＤＮＡ... 详细信息

本文通过设计选择大肠杆菌高频利用密码子代替天然密码子，人工全合成３２个寡聚核苷酸片段；连接并克隆获得Ａ（２７８ｂｐ）、Ｂ（８８ｂｐ）、Ｃ（２２４ｂｐ）３个较大ＤＮＡ片段；经重组克隆、定位突变等获得阳性克隆；双向ＤＮＡ序列测定分析表明获得了两种人工全合成牛生长激素（ｂＧＨ）编码基因，即编码Ｎ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－ｂＧＨ和Ｎ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－ｂＧＨ的两个基因，而至今尚未见有人工全合成ｂＧＨ基因的报道。构建了在ＰＬｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下含上述合成基因的表达质位ｐＢＬｂＧＨＥ７Ａ１和ｐＢＬｂＧＨＥ８，并在大肠杆菌中进行了温敏诱导表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，表达产物占全菌蛋白的３７％以上。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析和纯化产物的Ｎ端氨基酸序列测定结果都表明上述两种人工全合成ｂＧＨ基因在大肠杆菌中得到了高效表达，表达量为现今国际文献报道的高限水平。

关键词：牛生长激素基因 DNA人工合成基因表达

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胰岛素蛋白质工程：［B9Glu］人胰岛素

生物化学与生物物理学报 1996年第3期28卷 245-249页

作者：刘滨梁镇和唐月华张新堂朱尚权冯佑民中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室

用基因定位突变方法将胰岛素Ｂ链第９位的Ｓｅｒ改为Ｇｌｕ。获得速效胰岛素─—［Ｂ９Ｇｌｕ］人胰岛素．它的受体结合能力和体内生物活力分别为猪胰岛素的２１％和４０％。

关键词： [B9Glu]人胰岛素蛋白质工程速效胰岛素

寡聚脱氧核苷酸d(G-C)_3的激光喇曼谱及其分析

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生物化学杂志 1992年第5期8卷 553-559页

作者：黄汝多戴艳姿龚立三黄德民梁镇和汤锦炎崔益本王振海刘颂豪安徽大学生物系中国科学院安徽光机所合肥230031 华南师范大学广州510631 中国科学院上海生化所上海200031

用改进的固相磷酰三酯法合成了oligo-d(G-C)_3。以氩离子激光为激发光源,波长488nm.,在室温条件下,分别测定了纯化后的oligo-d(G-C)_3和其组分单体5’-dGMP和5’-dCMP的激光喇曼谱。观察到被测定的物质在300-2500cm^(-1)频率区间,各自... 详细信息

用改进的固相磷酰三酯法合成了oligo-d(G-C)_3。以氩离子激光为激发光源,波长488nm.,在室温条件下,分别测定了纯化后的oligo-d(G-C)_3和其组分单体5’-dGMP和5’-dCMP的激光喇曼谱。观察到被测定的物质在300-2500cm^(-1)频率区间,各自都有其特征的谱形和喇曼峰。5’-dGMP和5’-dCMP谱中大多数特征峰在寡聚体的谱中消失,而在oligo-d(G-C)_3谱中出现了几处新的喇曼峰。经查证,峰832,851和899cm^(-1)系糖-磷酸主链的特征喇曼峰,另外几处峰与DNA的构象有关。实验结果表明oligo-d(G-C)_3在水溶液中(室温)主要以B-构象存在。

关键词：激光喇漫谱脱氧核苷酸

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