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丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶抗原性分析及特异性抗体制备

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中华微生物学和免疫学杂志 2002年第4期22卷 393-397页

作者：杜桂鑫刘树玲侯利华陈万荣王海涛军事医学科学院微生物流行病研究所应用分子生物学实验室北京100071

目的　分析丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶的抗原性并制备特异性抗体。方法　构建表达质粒并且在大肠杆菌中可溶性表达单链型丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶 ;以纯化后的重组蛋白包被酶联板对 86份献血员和 12份健康人血清中的特异性抗体进... 详细信息

目的　分析丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶的抗原性并制备特异性抗体。方法　构建表达质粒并且在大肠杆菌中可溶性表达单链型丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶 ;以纯化后的重组蛋白包被酶联板对 86份献血员和 12份健康人血清中的特异性抗体进行检测 ;将纯化蛋白偶联到Sepha rose 4B上制备亲和纯化柱 ,对丙肝病毒感染者血清中的特异性抗体进行亲和纯化 ;以纯化蛋白免疫小鼠 ,制备特异性单克隆抗体 ,对纯化后的人多抗和鼠单抗进行鉴定。结果　以纯化的重组单链丝氨酸蛋白酶为抗原检测 98份血清 ,结果阳性率为 73.9%,商品试剂盒漏检的 1份血清中也检测出特异性抗体。用重组蛋白从 2 0 0mlHCV感染者血清中亲和纯化到 4.5 7mg多克隆抗体 ,效价达 10 7,特异性很好。制备的 4株IgG类鼠单抗 ,无交叉反应 ,能够被人血清抗体竞争性抑制。结论　表达的HCV丝氨酸蛋白酶具有良好的抗原性 ,在HCV感染人群中该区域抗体的阳性率较高 ,制备了特异性很好的多克隆抗体和单克隆抗体。

关键词：抗体制备丙型肝炎病毒抗原性单克隆抗体丝氨酸蛋白酶 HCV 丙型肝炎

抗甲型肝炎病毒抗体Fab在大肠杆菌中的表达

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免疫学杂志 2002年第2期18卷 149-152页

作者：于长明宋宏彬杜桂鑫徐静徐志凯王海涛军事医学科学院微生物流行病学研究所北京100071 第四军医大学微生物学教研室陕西西安710032

目的在大肠杆菌中高效表达人源抗HAV抗体Fab，为进一步研究该抗体的功能奠定基础。方法依次将抗HAV抗体的Fd及轻链基因克隆到表达载体pASK84的不同信号序列下，构建成Fab表达质粒，在大肠杆菌JM83中进行表达，并对表达产物进行复性。用S... 详细信息

目的在大肠杆菌中高效表达人源抗HAV抗体Fab，为进一步研究该抗体的功能奠定基础。方法依次将抗HAV抗体的Fd及轻链基因克隆到表达载体pASK84的不同信号序列下，构建成Fab表达质粒，在大肠杆菌JM83中进行表达，并对表达产物进行复性。用SDS-PAGE、western blot和ELISA法检测Fab的表达及其与甲肝病毒抗原的结合活性。结果构建了抗HAV Fab的重组表达质粒p84Fab，在大肠杆菌JM83中获得表达，表达的Fab占全菌的25%，主要以包涵体形式存在，复性后具有抗原结合活性；培养基、菌体可溶性蛋白部分也能检测到有抗原结合活性的Fab。结论抗HAV抗体Fab在大肠杆菌中得到了表达，并具有良好的抗原结合活性。

关键词：甲型肝炎病毒 Fab 基因表达 HAV抗体大肠杆菌抗原结合活性

丙型肝炎病毒RNA聚合酶可溶性和抗原性的研究

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中华肝脏病杂志 2001年第S1期9卷 69-72页

作者：侯利华杜桂鑫来大志王海涛军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

目的在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达ＨＣＶＲＮＡ聚合酶，研究其可溶性的条件，进一步研究它的抗原性，为研究其活性打下基础。方法构建表达载体ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１。在Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５）菌株中表达。在不同诱... 详细信息

目的在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达ＨＣＶＲＮＡ聚合酶，研究其可溶性的条件，进一步研究它的抗原性，为研究其活性打下基础。方法构建表达载体ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１。在Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５）菌株中表达。在不同诱导条件下分析其可溶性，在获得ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１可溶性蛋白后，通过Ｎｉ－ＮＴＡ柱纯化。纯化后得到的目的蛋白进行ＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达了ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和ｐＱＥ－５Ｂ－△ Ｃ２１重组蛋白，二者在３７℃诱导条件下均以包涵体形式存在，ｐＱＥ－５Ｂ－△２１重组蛋白在１８℃诱导条件下５０％以可溶形式存在，通过ＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表明该蛋白具有抗原性。结论在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达的ＨＣＶＲＮＡ聚合酶有良好的可溶性及抗原性。

关键词：肝炎病毒丙型 RNA聚合酶蛋白表达 ELISA

抗人整合素ανβ_3 单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建和表达

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2004年第5期32卷 9-13页

作者：王臣侯利华张彦明李建民廖振林杜桂鑫陈薇童贻刚西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

　为构建抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面表达,采用PCR方法从整合素ανβ3单抗E10ScFv载体中,扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因。将VH基因与人重链恒定区CH1基因连接,VL基因与人CK基因连接... 详细信息

　为构建抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面表达,采用PCR方法从整合素ανβ3单抗E10ScFv载体中,扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因。将VH基因与人重链恒定区CH1基因连接,VL基因与人CK基因连接,分别构建了鼠/人嵌合重链FD基因和轻链基因,将其克隆入pComb3,构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,用辅助噬菌体VCSM13超感染,间接ELISA及竞争抑制ELISA检测鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体活性。结果成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面展示了可结合人整合素ανβ3抗原的鼠/人嵌合Fab抗体。

关键词：整合素ανβ3 噬菌体展示 PCR 肿瘤血管形成细胞粘附分子鼠/人嵌合Fab抗体

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ_3 mAb的人源化Fab

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第1期23卷 64-67页

作者：王臣侯利华杜桂鑫李建明陈溥言童贻刚南京农业大学动物医学院江苏南京210095 军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ... 详细信息

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。

关键词：噬菌体抗体库整合素ανβ3 人源化Fab

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽的筛选和鉴定

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微生物学报 2002年第3期42卷 298-304页

作者：杜桂鑫侯利华陈万荣张永国王海涛军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶在病毒复制和包装中的重要作用使其成为特异性抗病毒药物研究的首选靶标。根据丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,用柔性连接子连接NS3丝氨酸蛋白酶结构域和NS4A的核心序列 ,构建成单链丝氨酸蛋白酶基因并且在大肠杆... 详细信息

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶在病毒复制和包装中的重要作用使其成为特异性抗病毒药物研究的首选靶标。根据丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,用柔性连接子连接NS3丝氨酸蛋白酶结构域和NS4A的核心序列 ,构建成单链丝氨酸蛋白酶基因并且在大肠杆菌中获得高水平的可溶性表达 ,纯化后的目的蛋白能够切割重组蛋白底物NS5ab。随后 ,以单链丝氨酸蛋白酶为靶分子对噬菌体展示的随机十二肽库进行了三轮淘筛 ,挑选的 44个克隆中有 3 7个克隆能够特异性地结合丝氨酸蛋白酶 ,并且这种结合作用为竞争性ELISA试验结果所支持。对 1 3个克隆进行序列测定 ,得到 6种序列 ,它们在氨基酸组成上存在明显偏性 ,富含组氨酸和色氨酸 ,缺乏酸性氨基酸 ;

关键词：丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽筛选鉴定噬菌体展示肽库

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丙型肝炎病毒准种在NS2区的变异状况初探

中国病毒学 2001年第3期16卷 215-219页

作者：冷彦陈秀珠杜勇毛春生杜桂鑫王海涛华中科技大学同济医学院附属同济医院分子医学中心湖北武汉430030 华中科技大学同济医学院基础医学研究所病毒学研究室湖北武汉430030 军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

探讨HCV准种在NS2区的基因结构特征及变异状况。利用逆转录巢式PCR从 1份HCV慢性携带者的阳性血清及 1份丙肝患者的血清中获得HCVNS2全长cDNA ,将其克隆于T载体 ,各随机挑取 5个阳性克隆进行序列测定。结果显示克隆到HCVNS2全长基因 ... 详细信息

探讨HCV准种在NS2区的基因结构特征及变异状况。利用逆转录巢式PCR从 1份HCV慢性携带者的阳性血清及 1份丙肝患者的血清中获得HCVNS2全长cDNA ,将其克隆于T载体 ,各随机挑取 5个阳性克隆进行序列测定。结果显示克隆到HCVNS2全长基因 ,所测克隆在核苷酸水平和氨基酸水平互不相同。该慢性携带者HCVNS2区序列以完整读码框架 (ORF)为主 ,一个于HCV多聚蛋白第 835位氨基酸的位置出现终止信号 ,而该丙型肝炎患者以NS2N端发现终止信号的序列为主 ,其中三个于第 835位氨基酸的位置出现终止信号 ,一个于第 887位氨基酸的位置出现终止信号 ,仅一个克隆的序列为完整ORF。对ORF完整的序列进行比较 ,发现丙型肝炎患者氨基酸变异主要集中于N端 ,蛋白二级结构模拟显示丙肝患者NS2与慢性携带者的优势二级结构类似。研究表明从我们选择的两例感染者的HCVNS2序列看 ,不同临床类型的HCV病人体内的HCV准种在NS2区存在差异 ,这种差异可能与病毒存在于机体的状态有一定的一致性。

关键词：丙型肝炎病毒准种 NS2区变异

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噬菌体抗体库技术研究进展

国外医学（免疫学分册） 1999年第6期22卷 350-354页

作者：杜桂鑫王海涛军事医学科学院微生物与流行病研究所

噬菌体抗体组合文库技术作为噬菌体展示和抗体组合文库两种技术的集成，自１９９０年建立以来，经过不断发展，目前被广泛用于生物医学的许多领域。本文主要就近年来该技术在抗体基因扩增、载体构建、筛选方法和亲和力成熟等方面的进... 详细信息

噬菌体抗体组合文库技术作为噬菌体展示和抗体组合文库两种技术的集成，自１９９０年建立以来，经过不断发展，目前被广泛用于生物医学的许多领域。本文主要就近年来该技术在抗体基因扩增、载体构建、筛选方法和亲和力成熟等方面的进展进行综述。

关键词：噬菌体抗体库载体

人源性抗HIV-1 V3环噬菌体抗体的基因克隆与序列分析

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细胞与分子免疫学杂志 1999年第3期15卷 178-181页

作者：毛春生李季枝宋宏彬于长明杜桂鑫王海涛军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

以HIV1gp120V3环的合成环肽为抗原,从人的噬菌体抗体组合文库中,筛选出与HIV1V3肽具有结合活性的人源性噬菌体抗体(Fab段)。用ELISA测定其活性,竞争抑制实验证实了该噬菌体抗体的特异性。序列分析表明,重链基因为IgG1亚类,可变区属VHI亚... 详细信息

以HIV1gp120V3环的合成环肽为抗原,从人的噬菌体抗体组合文库中,筛选出与HIV1V3肽具有结合活性的人源性噬菌体抗体(Fab段)。用ELISA测定其活性,竞争抑制实验证实了该噬菌体抗体的特异性。序列分析表明,重链基因为IgG1亚类,可变区属VHI亚组,与胚系基因DP88的同源性最高,D区为D33,J区为JH5;轻链为κ亚型,可变区属VLIV亚群,D区为DPK22,J链为JK4胚系。

关键词：噬菌体抗体 HIV-1 V3环核苷酸序列基因克隆