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SEPT12基因突变导致弱畸精子症引起男性不育

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安徽医科大学学报 2024年第6期59卷 939-946页

作者：郭森朝于慧顾梦吴宝燕李阔阔汤冬冬贺小进曹云霞吕明荣安徽医科大学第一附属医院妇产科合肥230032 国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室合肥230032

目的研究septins基因家族成员SEPT12在人类精子发生过程的作用及其对精子运动力和精子超微结构的影响。方法对收集的375例弱畸精子症患者外周血提取DNA进行全外显子测序(WES),筛选出一例携带SEPT12复合杂合突变的特发性不育患者,行Sange... 详细信息

目的研究septins基因家族成员SEPT12在人类精子发生过程的作用及其对精子运动力和精子超微结构的影响。方法对收集的375例弱畸精子症患者外周血提取DNA进行全外显子测序(WES),筛选出一例携带SEPT12复合杂合突变的特发性不育患者,行Sanger测序验证,家系共分离分析。用苏木精-伊红染色(HE)及扫描电镜(SEM)分析患者精子形态畸形,透射电镜(TEM)分析精子超微结构缺陷。然后,通过Western blot及免疫荧光(IF)分析突变对其蛋白水平及位置的影响及缺陷结构标志物位置及水平的变化情况。结果在1位弱畸精子症患者中筛选并鉴定SEPT12基因复合杂合突变c.C332A(p.T111K)和c.406_416 del TGCTCGTATTG(p.q 136 VFS*39)。Sanger测序验证,符合家系共分离遗传模式。突变导致其蛋白表达缺失、精子活力降低和精子形态畸形,主要包括短尾、卷尾、精子头部不规则。精子超微结构显示精子鞭毛中段与主段连接处的环缺失、精子头部顶体膜脱落、核空泡。精子鞭毛中段线粒体鞘排列紊乱、中央二联管缺失、微管双联体缺失及部分放射轴辐缺失。Western blot及IF结果显示SEPT家族相关蛋白SEPT4蛋白水平降低,SEPT6蛋白不变,顶体相关蛋白ACTL7A和ACROSIN蛋白缺失,线粒体及轴丝相关蛋白TOMM20,SPAG6和RSPH3蛋白水平显著降低。结论SEPT12基因突变引起SEPT12蛋白缺失,导致精子鞭毛中段与主段连接处环缺失,引起精子顶体、线粒体鞘及鞭毛组装异常。

关键词：男性不育弱畸精子症 SEPT12 全外显子测序

无支架间充质干细胞TEC修复猪膝关节软骨缺损的实验研究

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无支架间充质干细胞TEC修复猪膝关节软骨缺损的实验研究

作者：李阔阔深圳大学

学位级别：硕士

实验目的:目前干细胞疗法成为软骨修复领域新的研究方向,以间充质干细胞（MSCs）为细胞源构建的无支架组织工程体（TEC）在修复软骨损伤方面已取得较好的治疗效果。本研究通过提取、扩增猪关节液间充质干细胞（SFMSCs）,并采用组织工程... 详细信息

实验目的:目前干细胞疗法成为软骨修复领域新的研究方向,以间充质干细胞（MSCs）为细胞源构建的无支架组织工程体（TEC）在修复软骨损伤方面已取得较好的治疗效果。本研究通过提取、扩增猪关节液间充质干细胞（SFMSCs）,并采用组织工程技术构建无支架间充质干细胞组织工程构建体（SFMSCs-TEC）,然后移植修复小型猪膝关节软骨缺损,并与目前常使用的MSC复合透明质酸（HA）注射方法相对比,评价SFMSCs-TEC移植修复软骨缺损的效果。实验方法:采集5只6月龄五指山猪膝关节液,分离、培养得到大量SFMSCs,采用组织工程技术构建无支架SFMSCs-TEC,双侧股骨滑车制作软骨缺损模型,左侧采用所构建的TEC进行软骨缺损修复（SFMSCs-TEC组）,右侧采用SFMSCs复合HA注射方法进行治疗（SFMSCs-HA组）,术后3月分别对两组取材,行大体观察、MR影像学检查、HE染色、甲苯胺蓝染色、CollagenⅡ免疫组化染色,并参照国际软骨修复协会（ICRS）软骨修复评分系统进行大体评分和组织学评分,统计学分析评价两组修复效果。实验结果:以猪关节液间充质干细胞为细胞源,成功构建了无支架SFMSCs-TEC。术后3月两组实验结果:（1）大体观察:SFMSCs-TEC组软骨缺损部位基本被灰白色软骨样组织填充,表面相对平整,修复组织与正常组织分界模糊。SFMSCs-HA组软骨缺损部位仍可见明显的凹陷,灰白色软骨组织较薄,与周围分界明显,部分样本均可见明显的滑膜炎及关节积液表现。（2）MR影像学检查:SFMSCs-TEC组和SFMSCs-HA组比较,修复组织的表面及内部信号、软骨下骨水肿信号、关节腔关节液信号,前者均好于对照组。（3）HE染色、甲苯胺蓝染色、CollagenⅡ免疫组化染色显示SFMSCs-TEC组可见新生透明软骨,与周围正常组织分界模糊,细胞外基质异染阳性,SFMSCs-HA组可见纤维软骨修复,与周围正常组织分界清晰,细胞外基质未见异染。（4）ICRS大体评分:SFMSCs-TEC组和SFMSCs-HA组分别为9.67±1.04、5.75±1.38,两组差异比较具有统计学意义（P＜0.05）ICRS组织学评分:实验组和SFMSCs-HA组分别为9.74±1.91、5.43±1.18。两组差异比较具有统计学意义（P＜0.05）。实验结论:无支架SFMSCs-TEC技术与SFMSCs复合HA治疗猪膝关节软骨缺损短期效果相比较,前者具有较好的修复效果,可以更多的进行透明软骨样修复,减轻关节炎性反应。

关键词：无支架组织工程间充质干细胞软骨缺损

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体在体内抗病毒感染的初步验证

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猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体在体内抗病毒感染的初步验证

作者：李阔阔西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以怀孕母猪流产和不同年龄段猪的呼吸道疾病为临床特征的病毒性传染病。PRRSV具有逃逸宿主体液免疫应答机制等特征,导致现阶段商品化的疫苗不能给猪群提供完全的... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以怀孕母猪流产和不同年龄段猪的呼吸道疾病为临床特征的病毒性传染病。PRRSV具有逃逸宿主体液免疫应答机制等特征,导致现阶段商品化的疫苗不能给猪群提供完全的保护作用,且目前尚未得知有效的治疗方法,该病给我国养猪业带来巨大的经济损失。前期研究中,本实验室将PRRSV非结构蛋白Nsp9特异性纳米抗体Nb6基因通过(GS) Linker与细胞穿膜肽TAT基因融合,克隆至pET21b载体,成功构建pET21b-TAT-Nb6表达载体。原核表达获得的TAT-Nb6重组蛋白具有与Nsp9重组蛋白相互作用的活性,并且能够进入MARC-145细胞和原代细胞PAM中,可以抑制多株PRRSV毒株(包括基因1型(GZ11-G1)与2型(SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332))在以上两种细胞中的复制(Wang et al.2019)。因此,TAT-Nb6具有开发为新型抗PRRSV纳米抗体药物的潜力。基于以上背景,本研究通过对TAT-Nb6诱导表达温度、IPTG添加量和诱导表达时间的摸索,确定最佳的诱导表达条件,从而制备大量TAT-Nb6重组蛋白,对其在猪体内抗PRRSV作用进行验证,为抗PRRSV纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。主要研究内容及结果如下:***-Nb6重组蛋白优化表达条件:为了获得TAT-Nb6在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中最大表达量,我们将含有pET-21b-TAT-Nb6表达载体的大肠杆菌在不同条件下进行培养,如不同的诱导温度、诱导剂浓度和时间。通过SDS-PAGE和western blot分析。结果显示,TAT-Nb6重组蛋白在IPTG终浓度0.2 mM,37℃诱导6 h条件下诱导表达量最高。***-Nb6重组蛋白大量制备:TAT-Nb6重组蛋白在0.2 mM IPTG,37℃,6 h诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化、尿素梯度透析法复性和超滤管浓缩,成功制备TAT-Nb6重组蛋白共350 mg(6.25 mg/ml)。ELISA结果显示,TAT-Nb6与Nsp9蛋白有很强的的结合力;免疫组织化学结果显示,TAT-Nb6可以进入所有检测组织。***-Nb6重组蛋白在猪体内抗PRRSV病毒功能验证:本实验通过人工感染28-35日龄无特定病原体仔猪PRRSV JXA1毒株(10TCID)后,注射TAT-Nb6重组蛋白,检测不同天数仔猪体温、抗体和病毒血症的变化情况。结果显示,治疗组的体温和PRRSV抗体水平明显低于攻毒对照组,而血清中病毒含量无明显差异。TAT-Nb6在猪体内的抗病毒作用还需进一步验证。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 TAT-Nb6蛋白细胞穿膜肽纳米抗体

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杏鲍菇热风——真空冷冻干燥工艺优化

食品与机械 2017年第2期33卷 189-193页

作者：孙翠王钰沈小瑞李阔阔安徽大学资源与环境工程学院安徽合肥230601 安徽省中药材产业技术研发中心安徽合肥230601

为了提高杏鲍菇干燥速率、品质及降低能耗,采用Design-expert软件的Box-Benhnken方法设计,探讨热风温度、热风时间、真空冷冻干燥时间对干燥速率、感官得分、复水比和氨基酸的综合影响,在该基础上由试验数据推导出二次多项式回归模型,... 详细信息

为了提高杏鲍菇干燥速率、品质及降低能耗,采用Design-expert软件的Box-Benhnken方法设计,探讨热风温度、热风时间、真空冷冻干燥时间对干燥速率、感官得分、复水比和氨基酸的综合影响,在该基础上由试验数据推导出二次多项式回归模型,并对干燥工艺条件进行优化。结果表明:热风干燥温度55℃、热风时间54 min,真空冷冻干燥时间11h。联合干燥耗时和耗能分别比真空冷冻干燥减少25.5%,6.3%,比热风干燥减少156.4%,63.3%。

关键词：杏鲍菇能耗热风—真空冷冻干燥

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高产洛伐他汀红曲霉氮离子束诱变育种

食品与发酵工业 2016年第4期42卷 98-102页

作者：李阔阔王钰万田庄晓晓安徽大学资源与环境工程学院安徽合肥230601 安徽省中药材产业技术研发中心安徽合肥230601

为了提高洛伐他汀产量,以红曲霉M14为出发菌株进行N+束诱变。诱变剂量分别为:78×1013、130×1013、182×1013、234×1013N+/cm2,通过高效液相色谱检测诱变菌株发酵产物中洛伐他汀的含量,筛选正突变菌株。结果显示,诱变剂量为130×1013N... 详细信息

为了提高洛伐他汀产量,以红曲霉M14为出发菌株进行N+束诱变。诱变剂量分别为:78×1013、130×1013、182×1013、234×1013N+/cm2,通过高效液相色谱检测诱变菌株发酵产物中洛伐他汀的含量,筛选正突变菌株。结果显示,诱变剂量为130×1013N+/cm2时表现出相对较高的正突变率。最优诱变菌株M50-2洛伐他汀产量4.42 mg/g,相对于出发菌株提高70%。对其进行12次传代培养,发现产洛伐他汀的能力下降了2.3%,表现为良好的遗传稳定性,该菌株具有潜在的应用价值。

关键词：红曲霉洛伐他汀氮离子束诱变

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中职体育教育与体育社团的融合探索

冰雪体育创新研究 2023年第17期 140-142页

作者：李阔阔安徽亳州新能源学校安徽亳州236700

中职院校在开展体育教育的过程中可以把体育课堂教学和体育社团建设融合在一起,提升体育教学的整体效果,为学生的发展营造良好的环境。该文首先阐述了中职体育教育和体育社团融合的意义,然后分析了当前中职体育教育和体育社团融合的现状... 详细信息

中职院校在开展体育教育的过程中可以把体育课堂教学和体育社团建设融合在一起,提升体育教学的整体效果,为学生的发展营造良好的环境。该文首先阐述了中职体育教育和体育社团融合的意义,然后分析了当前中职体育教育和体育社团融合的现状,最后给出了中职体育教育和体育社团融合的策略,希望能够给当前的中职体育教学提供参考。

关键词：中职体育教育体育社团融合

蛹虫草高产虫草素复合诱变育种及固态发酵优化

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生物学杂志 2019年第2期36卷 103-106,117页

作者：孙翠王钰李阔阔陈达伟安徽大学资源与环境工程学院合肥230601

已成功选育出1株高产虫草素诱变菌株C1-7,以蛹虫草C-8为出发菌株,采用^(60)Coγ-UV复合诱变,并通过Design-expert法对其固态发酵条件进行优化分析。结果表明,前期温度为24℃、后期温度为21℃、初始含水量为64%的条件下,虫草素的产量最... 详细信息

已成功选育出1株高产虫草素诱变菌株C1-7,以蛹虫草C-8为出发菌株,采用^(60)Coγ-UV复合诱变,并通过Design-expert法对其固态发酵条件进行优化分析。结果表明,前期温度为24℃、后期温度为21℃、初始含水量为64%的条件下,虫草素的产量最高可达9.595 mg/g,相对于出发菌株提高132.9%。通过12代传代培养后,遗传稳定性良好,并且通过栽培得到诱变菌株子实体虫草素产量比出发菌株提高了100.2%,该菌株具有潜在的应用价值。

关键词：虫草素复合诱变蛹虫草响应面

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低产桔霉素红曲霉复合诱变育种

生物学杂志 2018年第1期35卷 104-106,124页

作者：庄晓晓王钰李阔阔沈小瑞安徽大学资源与环境工程学院合肥230601

以通过N+离子束诱变筛选出的高产洛伐他汀红曲霉菌株M50-2为出发菌株,进行紫外诱变,筛选低桔霉素产量菌株。将出发菌株置于30 W紫外灯下30 cm处分别照射30、60、90、120和150 s后,对所得诱变菌株进行液态发酵。采用高效液相色谱法(HPLC... 详细信息

以通过N+离子束诱变筛选出的高产洛伐他汀红曲霉菌株M50-2为出发菌株,进行紫外诱变,筛选低桔霉素产量菌株。将出发菌株置于30 W紫外灯下30 cm处分别照射30、60、90、120和150 s后,对所得诱变菌株进行液态发酵。采用高效液相色谱法(HPLC)中的荧光检测(λex=331 nm,λem=500 nm)和紫外检测(λ=238 nm)测定发酵产物中的桔霉素和洛伐他汀的含量。结果表明,通过紫外诱变,获得一株优良菌株。其液态发酵的产物中的桔霉素产量为2.15 mg/L,与出发菌株相比桔霉素含量减少了96.6%,而洛伐他汀产量为0.338 mg/m L,与出发菌株相比只减少了16.5%,对该菌株进行传代培养12代,结果表明该菌株具有较好的遗传稳定性。

关键词：红曲霉桔霉素洛伐他汀紫外诱变复合诱变

CFAP43或CFAP44基因突变致精子鞭毛多发形态异常患者的辅助生殖助孕结局研究

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中华生殖与避孕杂志 2022年第10期42卷 1014-1020页

作者：耿浩汤冬冬吴欢段宗流李阔阔许传吕明荣贺小进安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖医学中心生殖健康与遗传安徽省重点实验室国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室合肥230032

目的探讨CFAP43或CFAP44基因突变致精子鞭毛多发形态异常(multiple morphological abnormalities of the flagella,MMAF)患者行卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)助孕的临床结局。方法回顾性队列研究分析2014年9月至2020年7月期间于安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖医学中心就诊的121例MMAF男性不育症患者的临床资料和基因检测结果,纳入9例CFAP43或CFAP44基因突变MMAF患者,5例MMAF患者(P3、P5、P7、P8和P9)选择ICSI助孕治疗,统计并分析这5例患者ICSI助孕的临床结局。结果Sanger测序证实9例MMAF患者携带CFAP43或CFAP44基因双等位基因突变,其中3例患者的突变位点以往未曾报道,分别为CFAP43基因的新发纯合突变(c.4132delC:***1378Glufs*10)和新发复合杂合突变(c.3938G>A:***1313Gln;c.4342G>A:***1448Lys)以及CFAP44基因的新发复合杂合突变(c.1718C>A:***573His;c.4075G>A:***1359Lys)。5例MMAF患者夫妇接受5个ICSI周期,已生育4个健康亲生子代。CFAP43或CFAP44基因突变MMAF患者组ICSI受精率为76.47%(39/51),5例患者中临床妊娠3例,活产3例。与DNAH1基因突变MMAF患者组和严重少弱精子症患者组相比,CFAP43或CFAP44基因突变MMAF患者ICSI助孕结局差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论CFAP43或CFAP44基因突变会导致精子严重的鞭毛畸形和运动能力下降,是MMAF的重要病因。ICSI技术可以有效地解决CFAP43或CFAP44基因突变MMAF患者的生育难题。

关键词：精子注射,细胞质内全外显子组测序 CFAP43 CFAP44 精子鞭毛多发形态异常辅助生殖结局