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利用改良后的脾内免疫和半固体培养基法制备单克隆抗体

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生物技术通报 2013年第8期29卷 166-169页

作者：任瑞敏王云龙张怡青李恒思王国强李玉林王继创郑州大学生物工程系郑州450001 郑州职业技术学院郑州450121 河南师范大学生命科学学院新乡453003 河南省生物工程技术研究中心郑州450001

旨在利用改良后的脾内免疫和半固体培养基法制备单克隆抗体,节约免疫原用量、简化试验操作、一步法筛选和克隆杂交瘤细胞、缩短单抗制备周期。通过局部麻醉小鼠脾脏区域皮肤,切开后透过腹膜直接向脾脏内注射微量抗原,使小鼠的脾细胞在... 详细信息

旨在利用改良后的脾内免疫和半固体培养基法制备单克隆抗体,节约免疫原用量、简化试验操作、一步法筛选和克隆杂交瘤细胞、缩短单抗制备周期。通过局部麻醉小鼠脾脏区域皮肤,切开后透过腹膜直接向脾脏内注射微量抗原,使小鼠的脾细胞在短时间内产生免疫反应,尾静脉注射强化免疫后进行细胞融合;选取半固体培养基(甲基纤维素、软琼脂)法,以有限稀释法作对照筛选分泌高效价抗体的杂交瘤细胞。结果显示,与传统的单抗制备方法相比,改进后的脾内免疫操作更简单,联合尾静脉注射,使用微量免疫原在短时间内产生高效价抗体;半固体培养基甲基纤维素浓度在1.1%条件下,获得克隆团较多,阳性率较高。本研究方法适用于大规模制备单克隆抗体。

关键词：脾内免疫软琼脂培养法甲基纤维素法

H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立

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动物医学进展 2009年第6期30卷 30-35页

作者：王云龙陈小科韩洁李玉林李恒思王真邓黎黎郑州职业技术学院河南郑州450121 河南省生物工程技术研究中心河南郑州450001

通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列，构建重组质粒作为标准阳性模板。根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针。通过条件优化，以10倍系列稀释的质粒为标准品进... 详细信息

通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列，构建重组质粒作为标准阳性模板。根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针。通过条件优化，以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增，并制作标准曲线，建立了检测H3亚型猪流感的荧光定量PCR方法。结果表明，该方法检测灵敏度可达1．0×10^0拷贝／μL，线性范围为10^9-10^0，达10个数量级；对起始浓度为1．0×10^9、1．0×10^8、1．0×10^7拷贝／μL的标准品的最终实际测得值（Ct）分别为13．68，18．21和20．57；变异系数分别为0．31％、0．17％和0．12％，均小于5％，说明此方法具有良好的准确性和重现性。对阳性组织病料的检测表明，该方法的检测灵敏度高出常规PCR，与套式PCR具有相近的灵敏度。

关键词：猪流感病毒 H3亚型荧光定量PCR TaqMan探针

甲型流感病毒NP蛋白原核表达及其金标检测方法的建立

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动物医学进展 2010年第10期31卷 19-23页

作者：王云龙贾丽锋曹刚强李玉林李恒思昌静峰郑州大学河南郑州450001 河南省生物工程技术研究中心河南郑州450002

构建甲型流感病毒NP基因重组质粒,制备NP蛋白,建立甲型流感病毒胶体金检测方法。设计引物,扩增人工合成的甲型流感病毒株A(H5 N1)(GenBank登录号AY585439)NP DNA基因,构建pET-30 Xa/LIC-NP重组质粒,转化入原核表达系统***21 Gold中进行... 详细信息

构建甲型流感病毒NP基因重组质粒,制备NP蛋白,建立甲型流感病毒胶体金检测方法。设计引物,扩增人工合成的甲型流感病毒株A(H5 N1)(GenBank登录号AY585439)NP DNA基因,构建pET-30 Xa/LIC-NP重组质粒,转化入原核表达系统***21 Gold中进行表达和纯化。结果制备了纯度高达900 mL/L的甲型流感病毒NP融合蛋白,并初步建立了金标检测方法。

关键词：甲型流感病毒原核表达 NP蛋白胶体金检测

ER-α36过表达促进人乳腺癌MCF-7细胞侵袭转移能力

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基础医学与临床 2013年第6期33卷 713-717页

作者：刘旺根张钦宪王云龙孙新城王国强李恒思李玉林郑州大学基础医学院河南郑州450001 郑州职业技术学院生物工程系河南郑州450121 河南省生物工程技术研究中心河南郑州450001

目的探讨雌激素受体新亚型ER-α36过表达对人雌激素受体阳性乳腺癌细胞侵袭转移潜力的影响及其机制。方法以野生型乳腺癌细胞系MCF-7/W、转染pcDNA3.1空载体的细胞系MCF-7/pcDNA3.1和转染重组载体pcDNA3.1/ER-α36的细胞系MCF-7/ER-α3... 详细信息

目的探讨雌激素受体新亚型ER-α36过表达对人雌激素受体阳性乳腺癌细胞侵袭转移潜力的影响及其机制。方法以野生型乳腺癌细胞系MCF-7/W、转染pcDNA3.1空载体的细胞系MCF-7/pcDNA3.1和转染重组载体pcDNA3.1/ER-α36的细胞系MCF-7/ER-α36为研究对象,分别用细胞黏附实验观测肿瘤细胞与细胞外基质的黏附能力、Transwell侵袭小室实验检测细胞侵袭转移能力,用Western blot法检测NF-κB P65、MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表达。结果与MCF-7/W组细胞相比,MCF-7/ER-α36细胞的2 h细胞黏附率和24 h穿膜细胞数显著增加(P<0.05)。NF-κB P65、MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白的相对表达量及MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1显著增高(P<0.05)。结论 ER-α36过表达能促进ER-α66阳性乳腺癌细胞的体外黏附能力和侵袭转移潜力,其机制可能与通过NF-κB途径提高MMP-2、MMP-9的表达水平及打破二者与TIMP-1之间的平衡有关。

关键词：乳腺癌雌激素受体-α36 MCF-7细胞系侵袭转移核因子-κB

乙肝表面抗体和抗人红细胞单克隆抗体的F(ab′)_2偶联与鉴定

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动物医学进展 2010年第11期31卷 30-33页

作者：王云龙李兆学李恒思李玉林李忠信孙新城河南工业大学河南郑州450001 河南省生物工程技术研究中心河南郑州450001 郑州大学河南郑州450001

制备人红细胞非凝集型单克隆抗体,形成双功能抗体试剂,用于临床诊断。用人O型红细胞膜蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,制备非凝集型单克隆抗体,通过化学偶联法将非凝集性单克隆抗体和乙肝表面抗体的F(a... 详细信息

制备人红细胞非凝集型单克隆抗体,形成双功能抗体试剂,用于临床诊断。用人O型红细胞膜蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,制备非凝集型单克隆抗体,通过化学偶联法将非凝集性单克隆抗体和乙肝表面抗体的F(ab′)2片段偶联,制备出双功能抗体,用直接凝集法检测乙肝表面抗原。获得5株分泌非凝集型杂交瘤细胞,利用戊二醛一步法制备出双功能抗体,形成全血凝集检测试剂,并进行了初步鉴定。

关键词：人红细胞单克隆抗体双功能抗体全血凝集

Flag标签抗原的偶联及其单克隆抗体的应用研究

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动物医学进展 2011年第1期32卷 38-43页

作者：王云龙李忠信李恒思李玉林王继美刘旺根李兆学河南工业大学河南郑州450001 河南省生物工程技术研究中心河南郑州450001 郑州大学河南郑州450001

探讨不同免疫原制备抗Flag标签单克隆抗体的效果,以及Flag标签单克隆抗体在融合蛋白纯化中的应用。通过碳化二亚胺分别合成Flag-BSA、Flag-OVA、Flag-KLH3种完全抗原,采用SDS-PAGE和免疫效价对比方法确定偶联效果,选最优者利用杂交瘤技... 详细信息

探讨不同免疫原制备抗Flag标签单克隆抗体的效果,以及Flag标签单克隆抗体在融合蛋白纯化中的应用。通过碳化二亚胺分别合成Flag-BSA、Flag-OVA、Flag-KLH3种完全抗原,采用SDS-PAGE和免疫效价对比方法确定偶联效果,选最优者利用杂交瘤技术制备抗Flag标签单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水,并对其纯化、分析和鉴定。制备交联抗Flag-mAb的亲和层析柱,纯化带Flag标签的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳后薄层扫描分析纯度,用Western blot检测mAb对融合蛋白的反应性。Flag-KLH偶联效果最好,小鼠免疫效价在104以上,共制备3株抗Flag标签单克隆抗体杂交瘤细胞株2B-7、3C-5、5F-2,分泌抗体均为IgG1类型,与其他融合蛋白标签无交叉反应,经亲和层析纯化融合蛋白纯度达85%,且都可用于融合蛋白的Western blot检测,建立了带Flag标签的融合蛋白纯化和检测方法。成功偶联了Falg完全抗原并制备单克隆抗体,为带Flag标签的融合蛋白纯化提供重要工具。

关键词： Flag标签偶联单克隆抗体免疫亲和层析

甲型H1N1流感病毒血凝素基因的原核表达及用于胶体金检测方法的研究

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动物医学进展 2011年第7期32卷 1-4页

作者：王云龙郭文丽孙新城李玉林李恒思陈冬焕王真董彩文刘旺根河南师范大学河南新乡453007 郑州职业技术学院河南郑州450121 郑州大学河南郑州450001 河南省生物工程技术研究中心河南郑州450001

根据GenBank公布的甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列,合成HA全长基因,构建原核表达载体pET-30 Xa/LIC-HA。阳性质粒转化***21(DE3),IPTG诱导表达。对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测的结果表明,HA基因获得表达,产物具有免疫... 详细信息

根据GenBank公布的甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列,合成HA全长基因,构建原核表达载体pET-30 Xa/LIC-HA。阳性质粒转化***21(DE3),IPTG诱导表达。对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测的结果表明,HA基因获得表达,产物具有免疫学活性,分子质量约64 ku,以包涵体形式存在。以纯化的重组蛋白作为抗原初步建立了双抗原夹心检测甲型H1N1流感HA抗体的胶体金方法。该方法能检测出甲型H1N1流感阳性血清,为疫苗效果的评价奠定了基础。

关键词：甲型H1N1流感病毒血凝素原核表达胶体金

丁型肝炎病毒ORF5基因片段的原核表达及在ELISA中的初步应用

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动物医学进展 2012年第5期33卷 31-34页

作者：王云龙王娟李玉林董彩文孙新城张怡青王国强李恒思刘旺根河南师范大学河南新乡453007 郑州职业技术学院河南郑州450001 河南省生物工程技术研究中心河南郑州450001

为获得HDAg抗原,以含有ORF5编码区基因的pETHD质粒为模板进行PCR扩增得到500bp大小片段,经过BamHⅠ、HindⅢ双酶切,与载体pET-30a连接,构建重组表达质粒pET-30a/HDAg,再转入细胞BL21(DE3),经过IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析,表达蛋白分子... 详细信息

为获得HDAg抗原,以含有ORF5编码区基因的pETHD质粒为模板进行PCR扩增得到500bp大小片段,经过BamHⅠ、HindⅢ双酶切,与载体pET-30a连接,构建重组表达质粒pET-30a/HDAg,再转入细胞BL21(DE3),经过IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析,表达蛋白分子质量约27ku,经过Ni-NTA亲和层析纯化后,纯度达95%以上。将纯化的蛋白经HRP标记,初步建立ELISA捕获法,通过对24份标本检测和交叉反应试验,结果表明表达的抗原具有很好的反应原性和特异性,为建立丁型肝炎早期检测试剂盒提供材料。

关键词：丁型肝炎病毒丁肝抗原原核表达 ELISA

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锌合金件的返镀方法

电镀与精饰 2005年第6期27卷 9-9页

作者：李恒思广东金奇集团金属压铸厂 515834

锌合金件的电镀过程产生次品的原因较多.如:毛坯存在铸造缺陷,电镀前处理不良,或者电镀过程出现烧焦、麻点、毛刺等.这些不合格品如果报废会造成一定经济损失,选用商品锌合金退镀液成本较高,且质量并不理想,因此,选择一种简便、经济且... 详细信息

锌合金件的电镀过程产生次品的原因较多.如:毛坯存在铸造缺陷,电镀前处理不良,或者电镀过程出现烧焦、麻点、毛刺等.这些不合格品如果报废会造成一定经济损失,选用商品锌合金退镀液成本较高,且质量并不理想,因此,选择一种简便、经济且效果较好的返镀工艺也是电镀技术人员应该掌握的技术.

关键词：锌合金电镀过程经济损失技术人员电镀前处理铸造缺陷不合格品退镀液麻点