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Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达

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中国生物制品学杂志 2009年第4期22卷 348-350页

作者：朱大冕陈全李奕璇朱道银重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016

目的构建由Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以A549细胞基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子,替换pEGFP-C1载体中的CMV启动子,构建携带Survivin启动子的pEGFP-C1真核表达质... 详细信息

目的构建由Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以A549细胞基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子,替换pEGFP-C1载体中的CMV启动子,构建携带Survivin启动子的pEGFP-C1真核表达质粒pEGFP-C1/Surp,转染A549细胞及人胚肺成纤维细胞MRC-5,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果重组表达质粒pEGFP-C1/Surp经双酶切和测序鉴定,证明构建正确。转染A549细胞和MRC-5细胞后,在荧光显微镜下可见A549细胞有较强的绿色荧光,而MRC-5细胞则未见绿色荧光。结论已成功构建以Survivin启动子为调控序列、EGFP为标示蛋白的真核表达质粒,且具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤靶向性基因治疗载体奠定了基础。

关键词： Survivin 启动子增强型绿色荧光蛋白真核表达肺癌细胞基因治疗

肿瘤特异性hTERT启动子与Survivin启动子在肺癌A549细胞中的转录活性研究

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重庆医科大学学报 2009年第2期34卷 168-173页

作者：李奕璇陈全朱大冕重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016

目的:比较不同长度的hTERT启动子以及Survivin启动子在肺癌A549细胞中的启动活性,为肺癌靶向性基因治疗提供依据。方法:用PCR法扩增1084 bp hTERT启动子、980 bp Survivin启动子和红色荧光蛋白基因;在真核表达质粒pGL3-hTERT基础上分别... 详细信息

目的:比较不同长度的hTERT启动子以及Survivin启动子在肺癌A549细胞中的启动活性,为肺癌靶向性基因治疗提供依据。方法:用PCR法扩增1084 bp hTERT启动子、980 bp Survivin启动子和红色荧光蛋白基因;在真核表达质粒pGL3-hTERT基础上分别构建3种启动子调控的、以红色荧光蛋白CDS为目的基因的真核表达质粒pGL-H-RED、pGL-LH-RED和pGL-S-RED。将重组质粒用脂质体分别转染A549和MRC-5细胞,72h后用Imagepro-Plus6.0分析3种启动子在相同时间内启动红色荧光蛋白的表达水平。结果:重组质粒在A549细胞中观察到了红色荧光,在MRC-5细胞中无红色荧光。pGL-S-RED质粒在A549细胞中表达最强,pGL-LH-RED次之,pGL-H-RED最弱,3种质粒在A549细胞中的荧光强度(IOD)分别为201.17、171.70和136.34。结论:所克隆的hTERT启动子和Survivin启动子均表现出肿瘤特异性,其中Survivin启动子在肺癌A549细胞中具有最好的启动效应,可望开发成为肺癌靶向性基因治疗工具。

关键词：人端粒酶逆转录酶 survivin基因启动区(遗传学) 肺癌基因疗法

Survivin启动子调控sea基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达

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中国生物制品学杂志 2009年第2期22卷 147-149,157页

作者：李奕璇陈全朱大冕重庆医科大学免疫学教研室重庆400016

目的构建Survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以金黄葡萄球菌(ATCC25923)基因组为模板,PCR扩增sea基因。用sea基因替代以Survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED... 详细信息

目的构建Survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以金黄葡萄球菌(ATCC25923)基因组为模板,PCR扩增sea基因。用sea基因替代以Survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED质粒中的Red基因,构建真核表达质粒pGL-S-SEA。酶切及测序鉴定后,用脂质体转染A549细胞和MRC-5人胚肺成纤维细胞,RT-PCR检测两种细胞sea基因的转录情况。结果Survivin启动子调控的、以超抗原SEA编码序列CDS为目的基因的真核表达质粒pGL-S-SEA构建正确,并在A549细胞中启动了sea基因的转录,其强度为内参基因(GAPDH)的65.96%,而在MRC-5细胞对照中未检测到sea基因的转录。结论已成功构建Survivin启动子调控的sea基因真核表达质粒,Survivin启动子可在转录水平特异性地调控sea基因在A549细胞内表达,为下一步以其作为基因疫苗治疗肺癌奠定了基础。

关键词： Survivin启动子超抗原葡萄球菌肠毒素A 肺癌基因疗法

重庆市耐多药结核分枝杆菌gyrA与rrs基因突变特征分析

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中国人兽共患病学报 2016年第11期32卷 1001-1005页

作者：胡彦杨春逄宇卢楠刘洁沈静朱大冕冯鑫重庆医科大学病原生物学教研室重庆400016 重庆市结核病防治所结核病参比实验室重庆400050 中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心国家结核病参比实验室北京102206

目的分析重庆市耐多药结核分枝杆菌gyrA、rrs基因突变特征及其与氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、卡那霉素耐药(kanamycin,Km)的关系。方法对89株耐多药结核分枝杆菌的Ofx耐药相关基因gyrA和Km耐药相关基因rrs进行序列测定,分析其基因突变特... 详细信息

目的分析重庆市耐多药结核分枝杆菌gyrA、rrs基因突变特征及其与氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、卡那霉素耐药(kanamycin,Km)的关系。方法对89株耐多药结核分枝杆菌的Ofx耐药相关基因gyrA和Km耐药相关基因rrs进行序列测定,分析其基因突变特征。结果 89株MDR结核分枝杆菌中有50株对Ofx耐药,其中46株(92.00%,46/50)gyrA基因发生突变,突变位点包括74、89、90、91和94位密码子;22株耐Km菌株中,19株(86.36%,19/22)发生rrs基因突变,突变类型均为A1401G。Ofx、Km耐药株的gyrA、rrs基因突变率明显高于相应敏感株的基因突变率,两者之间的差异有统计学意义(χ2=62.937,P<0.001;Fisher双侧P<0.001)。结论 gyrA基因90、91、94位密码子突变是重庆市耐多药结核分枝杆菌Ofx耐药的主要机制;rrs基因A1401G突变则是Km耐药的主要原因。

关键词：分枝杆菌结核耐多药突变 gyrA基因 rrs基因

重庆市肺结核患者异烟肼与丙硫异烟胺耐药状况分析

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中国人兽共患病学报 2019年第2期35卷 173-178页

作者：王晓英刘洁沈静朱大冕重庆市结核病防治所结核病参比实验室重庆400050

目的了解重庆市结核分枝杆菌异烟肼(INH)、丙硫异烟胺(Pto)及其交叉耐药情况,为重庆市耐药结核病的防控提供参考。方法根据重庆市2015-2017年39个区县培养阳性菌株的传统药敏试验结果,收集288例INH或Pto任意耐药菌株,分析其耐药情况。结... 详细信息

目的了解重庆市结核分枝杆菌异烟肼(INH)、丙硫异烟胺(Pto)及其交叉耐药情况,为重庆市耐药结核病的防控提供参考。方法根据重庆市2015-2017年39个区县培养阳性菌株的传统药敏试验结果,收集288例INH或Pto任意耐药菌株,分析其耐药情况。结果 288例菌株中,INH耐药菌株285例,Pto耐药菌株19例,交叉耐药菌株16例。复治患者INH或Pto的耐药率均高于初治患者,年龄15～44岁患者Pto耐药率显著高于INH组。Pto耐药组Pre-XDR-TB及Ofx耐药率显著高于INH组。交叉耐药菌株中,年龄15～44岁组交叉耐药率较高,且MDR-TB发生率高达93.8%。结论重庆市INH与Pto耐药情况已较为严重,医生在为INH耐药患者制定化疗方案时应根据药敏结果,应谨慎选择Pto进行替代治疗,以避免更多耐药的发生。

关键词：异烟肼丙硫异烟胺耐药交叉耐药氧氟沙星

糖基化磷脂酰肌醇锚定型EGFP真核表达质粒的构建及表达

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生物技术通报 2009年第11期25卷 89-91,97页

作者：郭荫广陈全朱大冕重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016

构建与增强型绿色荧光蛋白基因相连的糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol,GPI)序列的真核表达质粒,并检测其在A549细胞中的表达。分离人外周血淋巴细胞,提取总RNA,以RT-PCR法扩增CD24基因的243bpGPI锚定序列,双酶切后定向... 详细信息

构建与增强型绿色荧光蛋白基因相连的糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol,GPI)序列的真核表达质粒,并检测其在A549细胞中的表达。分离人外周血淋巴细胞,提取总RNA,以RT-PCR法扩增CD24基因的243bpGPI锚定序列,双酶切后定向克隆入pEGFP-C1质粒中,构建并鉴定pEGFP-C1-GPI质粒。经脂质体介导转染A549细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。经酶切和测序鉴定证实,所克隆的CD24GPI序列正确,荧光显微镜观察pEGFP-C1-GPI质粒转染A549细胞可见围绕细胞膜的强绿色荧光,而对照pEGFP-C1质粒转染A549细胞仅见胞内均匀荧光。成功构建与EGFP相连的GPI真核表达质粒,且能在A549细胞膜上锚定表达EGFP-GPI融合蛋白,为构建锚定表达型肿瘤疫苗奠定基础。

关键词： GPI 真核表达载体 A549 绿色荧光蛋白

肿瘤特异的sea基因真核表达质粒的构建及在肺癌细胞中的功能研究

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生物技术通报 2009年第5期25卷 109-112,121页

作者：朱大冕陈全李奕璇朱道银重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016

构建Survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核表达质粒,检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达以及表达产物的超抗原活性。以PCR法扩增sea基因,以含有Survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED质粒为基础,构建pGL-S-SEA真核表达... 详细信息

构建Survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核表达质粒,检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达以及表达产物的超抗原活性。以PCR法扩增sea基因,以含有Survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED质粒为基础,构建pGL-S-SEA真核表达质粒。用脂质体转染A549细胞,以RT-PCR法检测sea基因表达水平。制备健康献血者PBMC,用pGL-S-SEA质粒转染A549细胞的上清液和细胞裂解液进行PBMC刺激试验,以MTT法检测其促细胞增殖效应。结果显示,成功构建Survivin启动子调控的真核表达质粒pGL-S-SEA。重组质粒在A549细胞中启动了sea基因的表达,其转录强度为内参(GADPH基因)的65.96%,在对照MRC-5细胞中无明显表达。该质粒转化A549细胞的裂解液具有促进人PBMC增殖活性、上清液无明显促PBMC增殖作用,裂解液组、上清液组和PHA阳性对照组的刺激指数分别为1.29、0.95和1.58。结论成功构建pGL-S-SEA质粒,其在A549细胞的表达产物具有诱导人PBMC增殖的超抗原活性,为下一步将其作为基因疫苗治疗肺癌奠定了基础。

关键词：葡萄球菌肠毒素A 肺癌基因治疗

结核分枝杆菌可变串联重复序列分型方法的应用

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中国热带医学 2023年第12期23卷 1323-1328页

作者：冯鑫胡彦詹建刘文果朱大冕沈静张婷余锋平重庆市结核病防治所结核病参比实验室重庆400050

目的通过基因分型探讨重庆市结核分枝杆菌分子流行病学特点,建立适合重庆市结核病基因分型的体系。方法复苏培养2019—2021年重庆市丰都县、奉节县2个国家级耐药监测点结核病患者痰培养菌株268例,提取菌株DNA,采用24位点可变串联重复序... 详细信息

目的通过基因分型探讨重庆市结核分枝杆菌分子流行病学特点,建立适合重庆市结核病基因分型的体系。方法复苏培养2019—2021年重庆市丰都县、奉节县2个国家级耐药监测点结核病患者痰培养菌株268例,提取菌株DNA,采用24位点可变串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTR)分型方法对菌株进行基因分型,并对成簇的菌株进行流行病学调查,分析2个监测点菌株的成簇率并比较其传播差异。结果2个地区菌株中奉节县的分辨率指数(Hunter-Gaston index,HGI)HGI指数从0到0.85,HGI 0.6以上的位点有10个;0.3≤HGI≤0.6的位点有11个;HGI<0.3的位点有3个。分辨力最高的位点为MIRU31,分辨力最低的位点为MIRU24。丰都县的HGI指数从0到0.81,HGI 0.6以上的位点有12个;0.3≤HGI≤0.6的位点有9个;HGI<0.3的位点有3个。分辨力最高的位点为MIRU26,分辨力最低的位点为MIRU23。在成簇性分析中,丰都县140例菌株中成簇的样本为10例,成簇数目为4簇,最大的1簇为4例样本,成簇率为4.1%。奉节县128例菌株中成簇的样本数为10例,成簇的数目为5簇,成簇率为4.2%。结论重庆市丰都县、奉节县发病的主要人群为独立的基因型,近期传播率较低。患者发病主要是内源性复燃即潜伏感染者发展为活动性肺结核,防控机构在对结核病患者进行规范化管理的同时,还应加大2个监测点潜伏感染者的筛查力度,对潜伏感染者进行预防性治疗,这是降低两地结核病疫情发病率的关键。

关键词：可变串联重复序列基因分型近期传播率潜伏感染重庆

重庆地区133株耐多药结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药基因突变特征分析

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重庆地区133株耐多药结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药基因突变特征分析