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菰黑粉菌MAPK基因UeKpp2和UeKpp6的功能研究

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菰黑粉菌MAPK基因UeKpp2和UeKpp6的功能研究

作者：曹乾超中国计量大学

学位级别：硕士

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种独特的病原真菌,其侵染茭白植株(Zizania latifolia)后可抑制植株抽穗开花并刺激茎基部膨大形成茭白。在东亚及东南亚地区尤其是中国,茭白是一种营养很高的水生蔬菜,也是一种重要的药材。前期研究发... 详细信息

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种独特的病原真菌,其侵染茭白植株(Zizania latifolia)后可抑制植株抽穗开花并刺激茎基部膨大形成茭白。在东亚及东南亚地区尤其是中国,茭白是一种营养很高的水生蔬菜,也是一种重要的药材。前期研究发现,菰黑粉菌是一种典型的二型态真菌,且与其他二型态真菌类似存在酵母型和菌丝型两种型态,而由酵母型向菌丝型转换是此类真菌致病性的关键。另外,促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号途径在病原真菌中广泛存在,其在菌株的二型态转换及致病性过程中起重要作用,目前该途径中对MAPK基因的研究相对较多。本研究利用菰黑粉菌基因组测序结果,结合玉米黑粉菌(Ustilago maydis)Kpp2和Kpp6的氨基酸序列,成功从菰黑粉菌中克隆并鉴定得到两个MAPK基因UeKpp2和UeKpp6。通过荧光定量PCR、基因修饰、融合及接种实验对UeKpp2和UeKpp6基因的表达模式和生物学功能进行了研究,并通过酵母双杂交实验对UeKpp2和UeKpp6可能参与的调控途径进行了探究。克隆得到菰黑粉菌MAPK基因UeKpp2,序列分析发现其开放阅读框为1065bp,无内含子,编码354个氨基酸且含有MAP激酶典型的TEY保守序列。聚类分析发现该蛋白属于Fus3/Kss1途径,与玉米黑粉菌、大麦坚黑粉菌(Ustilago hordei)等黑粉菌中的Kpp2同源性较高。互补实验表明UeKpp2基因可以互补玉米黑粉菌kpp2缺失引起的菌丝生长缺陷,对菌株的致病能力可能也有一定的提高。利用原生质体转化技术结合同源重组的原理获得一对性亲和的UeKpp2基因缺失菌株,进一步研究发现,UeKpp2基因缺失致使单倍体菌株多位点芽殖增多,但不影响其生长速率,而性亲和菌株间芽管形成及融合能力均急剧减弱。对UeKpp2在菰黑粉菌生长及侵染过程中的表达进行分析发现,UeKpp2的表达受菌丝生长诱导,且在侵染后期呈上调表达。另外,T型和MT型菌株中UeKpp2的表达对外界碳氮源刺激存在差异,但和菌丝生长能力相一致。酵母双杂交实验表明,UeKpp2可与UeFuz7及UePrf1蛋白互作。对UeKpp2基因缺失后UeFuz7及UePrf1的表达进行检测发现UeFuz7在菌丝生长后期下调表达,在培养24 h时UePrf1呈上调表达。进一步构建了△UeKpp2::UePrf1菌株,发现菌株融合能力有所恢复,表明UePrf1直接作用于UeKpp2的下游。接种实验发现,UeKpp2缺失影响菌株的致病性,但其能在茭白体内形成孢子。克隆并鉴定得到菰黑粉菌另一个MAPK基因UeKpp6,其开放阅读框为1737bp,无内含子,编码578个氨基酸,其编码的蛋白含有丝氨/苏氨酸双特异性蛋白激酶催化结构域,且与玉米黑粉菌Kpp6具有较高同源性。利用PEG介导的原生质体转化筛选获得UeT14△UeKpp6和UeT55△Ue Kpp6菌株,研究发现UeKpp6缺失对单倍体菌株的形态、生长速率均无影响,对性亲和菌株间的芽管生长及体外融合反应亦无影响。对UeKpp6的表达模式进行分析发现,UeKpp6在菌株侵染前期呈上调表达,且在体外菌丝生长后期表达量较高,碳氮源刺激下UeKpp6呈现不同的相对表达。酵母双杂交实验结果显示UeKpp6可与UePrf1蛋白互作,另外我们从菰黑粉菌cDNA文库中筛选到编码与UeKpp6互作蛋白的基因,包括g1616、g3286、g6433、g2188。UeKpp6基因缺失后UeKpp2的表达提早上调,而UePrf1在菌丝生长后期的表达显著下调。接种实验发现,△UeKpp6菌株能侵入茭白植株,且能在植株内形成菰黑粉菌孢子。

关键词：菰黑粉菌 MAPK UeKpp2 UeKpp6 融合菌丝生长蛋白互作致病性

乙二胺四乙酸二钠对异丙酚脂肪乳注射液污染微生物的影响

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中国药学杂志 2019年第18期54卷 1508-1510页

作者：易秋艳崔学文王灿曹乾超四川省食品药品检验检测院成都611731

目的研究比较含和不含乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的异丙酚脂肪乳注射液对微生物的影响。方法参照《中国药典》2015年版四部1121'抑菌效力检查法',以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉和白色念珠菌为试验菌,对含和不含EDTA... 详细信息

目的研究比较含和不含乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的异丙酚脂肪乳注射液对微生物的影响。方法参照《中国药典》2015年版四部1121'抑菌效力检查法',以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉和白色念珠菌为试验菌,对含和不含EDTA的异丙酚脂肪乳注射液各3批样品进行试验菌接种后12 h的存活菌数测定。结果供试品接种12 h后,与0 h比较,含EDTA的样品存活菌数均未增加,其中铜绿假单胞菌、大肠杆菌和白色念珠菌降低了约0. 5 lg值;不含EDTA的样品除存活菌数除黑曲霉未增加外,金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和白色念珠菌分别增加了0. 5、0. 4、0. 6、1. 6 lg值。结论与不含EDTA的异丙酚脂肪乳注射液相比,含EDTA的样品可降低意外污染引起的感染。但是,不能降低所有致病性威胁。

关键词：异丙酚脂肪乳注射液乙二胺四乙酸二钠抑菌性

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市售无添加防腐剂化妆品防腐体系效能评价

日用化学工业 2021年第10期51卷 975-980页

作者：李增婷吕鑫李倩曹乾超崔学文四川省药品检验研究院四川成都611731 四川大学华西公共卫生学院四川成都610041

通过中和剂验证、防腐挑战等试验对市售无添加防腐剂化妆品的防腐体系进行效能评价。采集无防腐剂的化妆品15批次,按《化妆品安全技术规范》(2015年版)(以下简称《规范》)进行菌落总数、霉菌和酵母菌以及pH值测定,参照GB 5009.238—201... 详细信息

通过中和剂验证、防腐挑战等试验对市售无添加防腐剂化妆品的防腐体系进行效能评价。采集无防腐剂的化妆品15批次,按《化妆品安全技术规范》(2015年版)(以下简称《规范》)进行菌落总数、霉菌和酵母菌以及pH值测定,参照GB 5009.238—2016《食品安全国家标准食品水分活度的测定》测定水活度,参考国外相关标准进行防腐挑战试验。菌落总数、霉菌和酵母菌的结果均符合《规范》要求。中和剂验证试验有3批(20%)需要替换中和剂或进一步稀释。防腐挑战试验中有14批细菌7天可下降大于99.9%,9批霉菌和酵母菌7天可下降大于90%。9批(60%)样品符合CTFA和AOAC非眼用化妆品的要求。样品普遍为弱酸性或中性,pH值最高9.73,最低4.68;水活度值集中在0.850~1.000,最低为0.643。综合结果表明:按《规范》进行化妆品微生物检验漏检风险较大,部分无添加防腐剂化妆品的防腐体系可能存在安全隐患;中和剂验证及防腐挑战试验亟需加入我国标准体系。

关键词：化妆品无添加防腐剂防腐体系效能评价

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菰黑粉菌的研究进展

长江蔬菜 2016年第6期 25-29页

作者：曹乾超张雅芬崔海峰叶子弘中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室杭州310018

柯卫东男,武汉市蔬菜科学研究所副所长兼水生蔬菜研究室主任,推广研究员,享受国务院政府特殊津贴,水生蔬菜行业计划及＂十二五＂国家科技支撑计划首席专家,主持国家及省、市重大科研项目多项,《植物遗传资源学报》、《长江蔬菜》编委。... 详细信息

柯卫东男,武汉市蔬菜科学研究所副所长兼水生蔬菜研究室主任,推广研究员,享受国务院政府特殊津贴,水生蔬菜行业计划及＂十二五＂国家科技支撑计划首席专家,主持国家及省、市重大科研项目多项,《植物遗传资源学报》、《长江蔬菜》编委。长期从事水生蔬菜种质资源及育种研究,在水生蔬菜种质资源保护及创新、新品种选育、微型种苗繁殖技术研究与应用等方面有创造性贡献,

关键词：菰黑粉菌水生蔬菜蔬菜科学研究肉质茎蔬菜种质资源推广研究员行业计划种质资源保护品种选育创造性贡献

基于深度学习的无人机影像城市植被智能分类研究

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基于深度学习的无人机影像城市植被智能分类研究

作者：曹乾洋贵州师范大学

学位级别：硕士

实现高精度高效率的城市植被遥感精细分类对城市土地利用变化、生态环境监测及城市绿地调查具有重要意义。然而,在城市植被精细分类时,传统遥感分类方法往往耗时耗力,分类精度难以达到实际需要,且分类结果容易存在误分、漏分的问题。随... 详细信息

实现高精度高效率的城市植被遥感精细分类对城市土地利用变化、生态环境监测及城市绿地调查具有重要意义。然而,在城市植被精细分类时,传统遥感分类方法往往耗时耗力,分类精度难以达到实际需要,且分类结果容易存在误分、漏分的问题。随着人工智能算法的发展,深度学习成为城市植被遥感分类的主流算法之一。深度学习网络的飞速发展,为城市植被遥感精细分类提供了智能算法的支撑。基于此,本文以2019年9月的无人机影像作为数据源,构建了一种基于深度学习的城市植被智能分类方法,通过结合特征工程有效提高了模型的植被分类精度。本文的主要研究内容及结论如下:(1)研究选取遵义市建成区典型的六个区域来制作城市植被分类样本。基于无人机影像对样本区植被进行目视解译,并制作植被二分类与多分类矢量标签。经过样本裁剪、正负样本平衡及数据增强建立了适用于深度学习城市植被分类的数据集。另外,通过实验确定了模型训练的最佳超参数,并在模型预测过程中采用忽略边缘策略来降低边缘信息丢失带来的影响。(2)本文以经典的DeepLabV3+网络结构为基础进行改进:1)替换主干网络,使用Moblie Net V2替换Xpection作为特征提取主干网络以提升模型效率;2)调整ASPP(Atrous Spatial Pyramid Pooling)空洞率,添加两个空洞率分别为2和4的3×3卷积,同时去掉空洞率为18的卷积,以此适应高分辨影像特征,从而提高模型的特征获取能力;3)加入注意力机制,在解码阶段加入CBAM(Convolutional Block Attention Module),从空间和通道两个维度增强对图像中的植被特征的筛选能力,以提高分类精度。另外,通过逐层验证的实验结果表明,本文在常规DeepLabV3+的基础上,所采用的改进机制对提升城市植被的分类效果均有效。(3)与FCN、ShuffleNetV2、U-Net进行了对比实验,结果表明。改进Deep Labv3+无论是分类精度还是运行效率都为最优,在植被二分类中,OA(Overall Accuracy)、F1-Score及IOU(Intersection Over Union)分别到达了94.03%、90.09%及84.07%,并且比轻量级网络ShuffleNetV2的训练时长还快了0.57h。在植被多分类中,改进DeepLabV3+在各个指标上依旧优于其他三种方法,综合指标OA、Marco F1、MIOU(Mean Intersection Over Union)分别比其他方法中效果最好的U-Net高出2.75%、3.63%、3.55%,模型训练时长依旧最短。另外,该模型能有效缓解植被分类中误分和漏分的问题,并且能够准确提取植被与其他地物相邻的植被像元。(4)为了弥补无人机可见光影像的波段数有限,特征信息丰富度不足的问题,本文构建了一种适合城市植被遥感分类的特征工程。该方法在特征优选算法下构建了特征工程,增加了样本中的特征量,使深度学习模型学习到更多的植被细节信息。该特征工程与改进DeepLabV3+结合后,整体精度指标OA、Marco F1、MIOU分别提高了1.93%、1.18%、4.91%,乔木、灌木、乔灌混合、天然草地和人工草地的IOU分别提高了3.71%、3.54%、2.69%、6.32%和8.25%。之后,经过迁移能力测试验证了该方法具有一定的迁移性与泛化性,并应用于整个遵义市建成区的植被分类任务。综上,本研究提出并论证了结合特征工程与深度学习的城市植被精细分类方法,实现了无人机影像下城市植被的智能分类。该方法具备一定的迁移能力,能快速、精确的对植被进行分类,适用于城市区域植被快速调查任务,能为城市生态资源调查和环境规划建设提供技术支持和科学依据。

关键词：城市植被无人机影像植被分类特征优选深度学习

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玉米秸秆和海藻共热解特性研究

新能源进展 2024年第1期12卷 98-105页

作者：曹乾坤王茜王睿山东建筑大学热能工程学院济南250101

为解决陆地生物质资源短缺,开发水生生物质有效替代部分陆地生物质迫在眉睫。通过热重法研究玉米秸秆和海藻共同热解的特性,重点考察掺混比例和升温速率的影响,并对混合样品的热力学特性和动力学特性进行分析。结果显示,热解分为干燥、... 详细信息

为解决陆地生物质资源短缺,开发水生生物质有效替代部分陆地生物质迫在眉睫。通过热重法研究玉米秸秆和海藻共同热解的特性,重点考察掺混比例和升温速率的影响,并对混合样品的热力学特性和动力学特性进行分析。结果显示,热解分为干燥、挥发分析出及焦炭热解三个阶段。掺配后的混合样品最终失重率与最大失重速率均小于纯秸秆与纯海藻。随着海藻掺配比例的增加,可燃性指数Ca先增大后减小,燃尽特性指数K递减,热解特性指数S先增大后减小。不同升温速率工况下,在热解区间(200~600℃),随着升温速率的升高,样品的热重曲线右移,失重率越来越大,最大失重速率先减小后增大,30℃/min时最小。Ca在递减,K、S呈增加趋势。动力学研究结果表明,不同掺配比例工况下,混合样品存在明显的协同作用,降低了共热解所需活化能。在不同升温速率工况下,升温速率越大,所需要的活化能越小,样品越容易发生热解。

关键词：玉米秸秆升温速率掺配比例活化能

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UeFuz7在菰黑粉菌二型态转换中的作用

植物病理学报 2019年第2期49卷 203-211页

作者：刘洪磊于金梦曹乾超陈彬倩陆朝晶叶子弘俞晓平张雅芬中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量与检验检疫技术重点实验室杭州310018 四川省食品药品检验检测院微生物检验中心成都611731

菰黑粉菌与茭白植株互作形成膨大肉质茎——茭白,已成为我国第二大水生蔬菜。作为一种二态性真菌,菰黑粉菌的二型态转换与侵染茭白密切相关,对茭白孕茭至关重要。本研究基于菰黑粉菌全基因组序列,采用t Blastn进行同源基因查找,克隆得... 详细信息

菰黑粉菌与茭白植株互作形成膨大肉质茎——茭白,已成为我国第二大水生蔬菜。作为一种二态性真菌,菰黑粉菌的二型态转换与侵染茭白密切相关,对茭白孕茭至关重要。本研究基于菰黑粉菌全基因组序列,采用t Blastn进行同源基因查找,克隆得到了玉米瘤黑粉菌Fuz7的同源基因UeFuz7。该基因c DNA全长1 308 bp,无内含子,编码435个氨基酸,在黑粉菌中相对保守。酵母双杂交实验发现,UeFuz7可与UeKpp2蛋白互作。同时其表达模式分析发现,在菰黑粉菌的二型态转换发生时UeFuz7的相对表达量最高。进一步通过PEG介导的原生质体转化获得UeFuz7突变体,表型分析发现:在二型态转换过程中,UeFuz7突变菌株的接合管形成和菌丝生长能力明显减弱。以上结果表明UeFuz7作用于菰黑粉菌的二型态转换。

关键词：菰黑粉菌 UeFuz7 二型态转换融合

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茭白人工孕茭体系的建立及优化

农业生物技术学报 2019年第8期27卷 1498-1512页

作者：殷淯梅张雅芬曹乾超胡鹏夏文强崔海峰俞晓平叶子弘中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室四川省食品药品检验检测院微生物检验中心

茭白是由活体营养型真菌—菰黑粉菌(Ustilago esculenta)侵染菰(Zizania latifolia)后,在菰茎部形成的可食用肉质茎,已成为我国第二大水生蔬菜。传统的茭白种植及育种途径人力、物力投入较大,田间种植的正常茭白常出现品种的退化,还容... 详细信息

茭白是由活体营养型真菌—菰黑粉菌(Ustilago esculenta)侵染菰(Zizania latifolia)后,在菰茎部形成的可食用肉质茎,已成为我国第二大水生蔬菜。传统的茭白种植及育种途径人力、物力投入较大,田间种植的正常茭白常出现品种的退化,还容易产生灰茭和雄茭,严重影响茭白种植的收益。本研究建立并优化了菰黑粉菌人工接种体系,即在25℃光照12 h,22℃黑暗12 h的温室环境中,以薹管萌发10～20 d的野生菰幼苗茎基部用OD600值为2.0的菰黑粉菌性亲和单倍体菌株UET1和UET2混合菌液注射,孕茭率达到80%以上。进一步通过转录组数据分析筛选出与灰茭中冬孢子发育的干扰因子基因(interfered factors in teliospores development, Itd1)(GenBank No. MK164419),通过同源重组的方法对菰黑粉菌单倍体菌株UET1和UET2进行基因敲除,获得1对冬孢子发育的干扰因子基因缺失菌株UET1ΔItd1(CGMCC No.16723)和UET2ΔItd1 (CGMCC No.16724),利用优化的人工接种技术侵染野生菰幼苗,获得了可以孕出正常茭白的植株。以上工作可以提供一种新的高效稳定的茭白育种途径,为实现茭白的人工育种提供可靠的理论及技术基础;同时对后续深入研究菰黑粉菌的二型态转换、菌丝生长或冬孢子形成提供理论基础。

关键词：菰黑粉菌茭白人工接种冬孢子发育的干扰因子基因(Itd1)

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菰黑粉菌分离方法的研究

长江蔬菜 2015年第22期 195-197页

作者：曹乾超张雅芬崔海峰俞晓平叶子弘中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室杭州310018

以龙茭2号正常茭为材料,分别采用切片、研磨2种方法分离菰黑粉菌,并通过形态观察及ITS-5.8S r DNA序列克隆测序确认。结果表明,对膨大茎进行切片或研磨均能分离得到菰黑粉菌,其ITS序列大小在750 bp左右,通过NCBI比对分析确认,其中研磨... 详细信息

以龙茭2号正常茭为材料,分别采用切片、研磨2种方法分离菰黑粉菌,并通过形态观察及ITS-5.8S r DNA序列克隆测序确认。结果表明,对膨大茎进行切片或研磨均能分离得到菰黑粉菌,其ITS序列大小在750 bp左右,通过NCBI比对分析确认,其中研磨法对新鲜组织的分离效率更高。

关键词：菰黑粉菌茭白分离方法 ITS