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AS-PCR方法检测中国人群CYP2C19基因多态性

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海南医学院学报 2010年第9期16卷 1101-1105,1110页

作者：薛丽叶玉兴易国辉白玉杰海南医学院科学实验中心海南海口571101 浙江大学-迪诺遗传与基因组医学研究中心浙江杭州310058

目的:建立一种快速、灵敏的细胞色素氧化酶P4502C19基因多态性检测方法。方法:分离外周血淋巴细胞基因组DNA,分别用一对等位基因特异性(allele-specific,AS)的反向引物与共用正向引物进行PCR扩增,通过电泳分析对应的PCR产物来判断CYP2C1... 详细信息

目的:建立一种快速、灵敏的细胞色素氧化酶P4502C19基因多态性检测方法。方法:分离外周血淋巴细胞基因组DNA,分别用一对等位基因特异性(allele-specific,AS)的反向引物与共用正向引物进行PCR扩增,通过电泳分析对应的PCR产物来判断CYP2C19基因型。在AS引物3′端倒数第三位或第二位引入错配碱基改进特异性。采用优化后方法对278例健康人进行CYP2C19基因型分析。结果:AS-PCR可检测CYP2C19基因多态性,引入第二个错配碱基可提高检测特异性。经直接测序验证结果完全一致。结论:建立和优化的AS-PCR方法适用于CYP2C19基因多态性快速检测。

关键词：细胞色素氧化酶2C19 遗传多态性基因型等位基因特异性PCR

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高密度发酵***组成型表达纤维素二糖水解酶

热带作物学报 2010年第8期31卷 1293-1297页

作者：崔艳艳易国辉屠发志张添元罗进贤张爱联中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室海南海口571101 海南大学农学院．海南儋州571737 中山大学基因工程教育部重点实验室／生物化学系广东广州510275

用PCR法扩增里氏木霉cbhⅡ基因,并将其克隆到***表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP9K-cbhⅡ。通过电转法将cbhⅡ基因整合到***的基因组中,然后筛选高G418抗性的克隆作为工程菌菌种。在生物反应器中生产CBHⅡ,将20L发酵液装入50L的发... 详细信息

用PCR法扩增里氏木霉cbhⅡ基因,并将其克隆到***表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP9K-cbhⅡ。通过电转法将cbhⅡ基因整合到***的基因组中,然后筛选高G418抗性的克隆作为工程菌菌种。在生物反应器中生产CBHⅡ,将20L发酵液装入50L的发酵罐中,在发酵过程中连续64h补加甘油-PTM4,放罐时生物量为A600=170,CBHⅡ的表达量为75mg/L。其表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性。

关键词：纤维素二糖水解酶毕赤酵母基因表达纤维素酶活力

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海南151例临床真菌感染病例分析

海南151例临床真菌感染病例分析

第七届生命科学联合学术大会

作者：易国辉李士博周利民何小稳吴金燕郭虹海南医学院科学实验中心

目的:调查分析临床真菌感染的分布特点,为预防和控制该病提供依据。方法:回顾性分析海南省人民医院2012-2014假丝酵母菌感染病例资料。总结分析病例的一般特征资料、年龄、性别、籍贯、疾病种类、感染因素、致病菌种、临床诊断、并发疾... 详细信息

目的:调查分析临床真菌感染的分布特点,为预防和控制该病提供依据。方法:回顾性分析海南省人民医院2012-2014假丝酵母菌感染病例资料。总结分析病例的一般特征资料、年龄、性别、籍贯、疾病种类、感染因素、致病菌种、临床诊断、并发疾病、治疗方案等方面的特征。结果:共收集海南省人民医院151例成年人住院病例。151病例中,男性患者78例(51.65%),女性患者73例(48.34%);其中最小年龄20岁,最大者90岁,平均年龄为55±19岁,60-69岁患病人数最多;151例假丝酵母菌感染病例中口腔假丝酵母菌病、假丝酵母菌性皮炎、假丝酵母菌性阴道炎等皮肤黏膜表浅的假丝酵母菌感染占89.40%,深部感染如败血症、肠炎、肺炎等占10.59%。151例病例中,入院时确诊疾病多为肿瘤、糖尿病、肺部感染、心脑血管疾病、皮肤病、HIV感染、妇科疾病。结论:151例假丝酵母菌感染病例中以皮肤黏膜等表浅的假丝酵母菌感染为主,侵入性感染以败血症、肺炎、肠道疾病为主;无性别差异,年龄组有差异;假丝酵母菌病患者只有23例确定了病原体种类,以白色假丝酵母菌居多,如能加强病原体种类和耐药性鉴定,可明确指导临床用药。

关键词：假丝酵母菌病表浅性侵入性

伯氏疟原虫哌喹抗性系感染小鼠的组织病理特征

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伯氏疟原虫哌喹抗性系感染小鼠的组织病理特征

2013海南省第五届生命科学联合学术会议

作者：黄宪希沈笑周利民易国辉薛伟玲郭虹海南医学院科学实验中心

在前期研究所建立的伯氏疟原虫(Plasmodium berghei,P.b.)哌喹(Pireraquine phospate,PQ)抗性系(PQR)鼠疟模型的基础上,通过对实验小鼠脾脏、肝脏、肾脏及脑组织切片的动态观察,从形态学角度观察比较PQR及哌喹敏感系(PQs)感染小鼠主要... 详细信息

在前期研究所建立的伯氏疟原虫(Plasmodium berghei,P.b.)哌喹(Pireraquine phospate,PQ)抗性系(PQR)鼠疟模型的基础上,通过对实验小鼠脾脏、肝脏、肾脏及脑组织切片的动态观察,从形态学角度观察比较PQR及哌喹敏感系(PQs)感染小鼠主要器官的组织病理学特征。方法:将昆明小鼠分为正常对照、PQS及PQR三组,PQs组及PQR组分别于腹腔接种1×107个感染PQS系及PQR系的红细胞,观察小鼠贫血程度及体征改变。于感染后PQs组3d、6d、9d,PQR组3d、6d、9d、12d、15d、17d、22d各取5只小鼠,取尾血涂片,Giemsa染色,计算原虫率。在各点取小鼠肝、肾、脾及脑组织经固定、石蜡包埋、切片及HE染色,最后光镜下观察各组织各时间点的特征性病理改变。结果:小鼠腹腔接种疟原虫后,PQS组存活时间火约是7～9d,而PQR组可存活到22d以上;PQs组接种3d后,原虫率为4%～7%;6d后为30%～35%,贫血严重;9d人于50%死亡;PQR组原虫率上升缓慢,3-9d保持在7%左右;此后,原虫率持续上升17d达高峰(50%),22d降为20%。两组小鼠均肝脾肿大,颜色暗紫;显微镜下观察,PQR组与PQS组相同的是肝组织可见炎性细胞聚集,肝血窦变大,淋巴细胞密集;脾组织内有大量疟色素沉积,炎性细胞增多。不同的是,PQR肝脾组织中的炎性细胞数量先上升后又下降。PQs组肾小球毛细血管和肾小管间质内有多量红细胞和疟原虫感染红细胞,而PQR没有明显变化。脑组织中,PQS组血管内见大量红细胞聚集成团块状,毛细血管内炎性细胞增多,而PQR很少有人量的红细胞聚集,未见团块结构。结论:***感染小鼠肝脾脑肾组织的炎性病理改变较重,***肝脾炎性病理改变与其原虫率的高低变化一致,而脑肾组织的疟疾炎性反应较轻;该数据对PQR系毒力及致病力显著下降的生物学表征提供了组织学实验依据。

关键词：伯氏疟原虫哌喹抗性组织病理

热带假丝酵母菌ERG11原核表达载体构建及表达

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热带假丝酵母菌ERG11原核表达载体构建及表达

第六届海南省生命科学联合学术会议

作者：吴金燕张瑜易国辉周利民薛伟玲郭虹海南医学院科学实验中心

研究背景临床假丝酵母菌的致病及耐药呈上升趋势;白假丝酵母菌靶位酶基因ERG11的突变和过度表达是其对唑类药物耐药的分子机制之一。然而,ERG11在热带假丝酵母菌对唑类药物的相关性研究较少,尚不确定。目的构建热带假丝酵母菌靶位酶ERG1... 详细信息

研究背景临床假丝酵母菌的致病及耐药呈上升趋势;白假丝酵母菌靶位酶基因ERG11的突变和过度表达是其对唑类药物耐药的分子机制之一。然而,ERG11在热带假丝酵母菌对唑类药物的相关性研究较少,尚不确定。目的构建热带假丝酵母菌靶位酶ERG11基因原核表达载体,为深入探讨耐药分子机制奠定基础。方法以热带假丝酵母菌氟康唑敏感株及耐药株为实验菌株,提取基因组DNA;根据GENEBANK ERG11基因序列设计引物、基因扩增;先构建pMD18-ERG11重组克隆载体,再构建pET-ERG11原核表达载体,经酶切、PCR及序列分析鉴定,转化BL21大肠杆菌;SDS-PAGE对表达产物进行了初步鉴定。结果PCR扩增出ERG11基因,片段大小与预期相符,约800bp,经酶切及PCR及测序鉴定为正确重组质粒;SDS-PAGA蛋白电泳观察,获得表达产物。结论构建成功热带假丝酵母菌靶位酶ERG11原核表达载体,为进一步探讨ERG11基因与氟康唑耐药的相关性奠定了实验基础。

关键词：热带假丝酵母菌 ERG11基因原核表达载体

QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA方法的建立

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海南医学院学报 2013年第9期19卷 1171-1174页

作者：凌奕金松易国辉袁媛陈芳黄振兰黄垂灿黄元华海南医学院附属医院产前诊断中心海南海口570201 深圳华大基因研究所广东深圳518083

目的:建立QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA的方法,并探讨其方法的稳定性、灵敏性与可靠性。方法:通过prime5.0设计出SRY与β-globin的TapMan探针,并对其QPCR反应体系进行优化。结果:分别得到了SRY与β-globin的引物及探针的反应最适浓... 详细信息

目的:建立QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA的方法,并探讨其方法的稳定性、灵敏性与可靠性。方法:通过prime5.0设计出SRY与β-globin的TapMan探针,并对其QPCR反应体系进行优化。结果:分别得到了SRY与β-globin的引物及探针的反应最适浓度比,建立了其最佳QPCR反应体系,并得出所需外周血的最少量。结论:成功建立了QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA的方法,该方法将可用于无创性相关产前诊断。

关键词： QPCR SRY基因 β-globin基因 cell free fetal DNA

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不同来源烟曲霉菌的分离及分子生物学鉴定

不同来源烟曲霉菌的分离及分子生物学鉴定

第六届海南省生命科学联合学术会议

作者：黄宪希张鹏程吴金燕易国辉周利民郭虹海南医学院科学实验中心

目的烟曲霉是最常见的空气播散性致病真菌,拟通过采集自然环境标本,对烟曲霉菌进行培养、分离及鉴定,建立烟曲霉菌分离鉴定技术。方法采集不同来源样本进行培养,乳酸棉兰染色,10%KOH染色镜下观察;提取基因组DNA,并扩增β-tubulin基因以... 详细信息

目的烟曲霉是最常见的空气播散性致病真菌,拟通过采集自然环境标本,对烟曲霉菌进行培养、分离及鉴定,建立烟曲霉菌分离鉴定技术。方法采集不同来源样本进行培养,乳酸棉兰染色,10%KOH染色镜下观察;提取基因组DNA,并扩增β-tubulin基因以鉴定烟曲霉菌,再进行烟曲霉细胞表面蛋白CSP扩增分型。结果采集不同来源:土壤、腐叶和空气各10份共30份样本,经马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养,共获得43株真菌,其中从土壤样本中分离19株,从腐叶样本中分离24株,空气中未获得;经β-tubulin PCR扩增鉴定,22株为烟曲霉菌,进一步经CSP基因扩增及序列测定,所获的烟曲霉菌分为2个基因型,t01型和t06A a型。结论不同的环境尤其是潮湿土壤及腐叶中易获得烟曲霉菌;建立了培养分离及分子鉴定烟曲霉菌的实验室技术。

关键词：烟曲霉菌 β-微管蛋白细胞表面蛋白分型

IFN-γ、IL-4、TNF-α在疟原虫抗哌喹系小鼠体内的动态表达

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IFN-γ、IL-4、TNF-α在疟原虫抗哌喹系小鼠体内的动态表达

第八届全国免疫学学术大会

作者：黄宪希周利民易国辉吴金燕吕芳丽郭虹海南医学院科学实验中心中山大学中山医学院寄生虫学教研室

研究背景:疟疾是严重的热带病之一,抗疟药物是防治的主要手段。不断出现的药物抗性问题亟待解决。哌喹(piperaquine,PQ)是重要的抗疟配伍及预防药物,抗性机制不明。课题组建立的鼠疟PQ抗性系模型显示了该虫系毒性明显减弱,感染鼠存活时... 详细信息

研究背景:疟疾是严重的热带病之一,抗疟药物是防治的主要手段。不断出现的药物抗性问题亟待解决。哌喹(piperaquine,PQ)是重要的抗疟配伍及预防药物,抗性机制不明。课题组建立的鼠疟PQ抗性系模型显示了该虫系毒性明显减弱,感染鼠存活时间显著延长等特征,其抗性相关免疫调节机制尚待阐明。目的:观察伯氏疟原虫(Plasmodium berghei,Pb)ANKA抗哌喹(PQ R)系小鼠感染免疫相关细胞因子的动态表达,探讨疟原虫抗性相关感染免疫调节机制。方法:65只昆明小鼠随机分为A、B、C3组,A组(敏感系PQS)C组(正常对照)各15只;B组(PQ R)35只(每个时间点5只,共7个点)A组和B组小鼠分别经腹腔感染Pb ANKA株Pb PQS系和Pb PQ R系红内期原虫1×107个(200μl血),C组注射等量生理盐水。于感染后A组0、3、6d、B组0、3、6、9、12、15、17及22d各取5只小鼠,采尾血制薄血膜镜检,计算红细胞原虫感染率(简称原虫率)。脱颈处死小鼠,无菌取脾制备脾淋巴细胞悬液,用酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定各组小鼠脾细胞IFN-γ、IL-4及TNF-α的分泌水平;Bio Reader 4000 Pro型ELISPOT自动图像分析仪读取数据。结果:ELISPOT计数结果显示,A、B组三种细胞因子的表达均显著高于正常组(C组,0d,P50%);B组观察至第22d时小鼠仍存活。B组IFN-γ3d低于A组(50.80±19.07/38.00±23.46;P>0.05);6d时则显著高于A组(57.40±23.36/141.80±55.28,P0.01);之后逐渐降低,17d时达较低点(54.40±11.74);22d再度升高(156.75±48.02)。IL-4的表达则在3d、6d时,A组均高于B组(3d:23.00±10.44/7.00±5.43;P0.01;6d:45.40±19.26/16.60±9.63;P0.01),在9d时最高(110.67±33.23),15d时降至15.60±10.04,22d又升高至25.25±9.22。TNF-α表达量在第3d及6d均为B组高于A组(3d:5.40±2.70/53.20±13.07;P0.01)6d为峰值,9d、12d逐渐下降,15d时降到较低点35.20±13.07,22d时略回升(36.83±19.47);B组原虫率变化为缓慢上升15d为27.60%±9.34%、17d降至7.60%±6.23%,22d升高(25.40%±7.36%);原虫率15d、17d及22d的变化与三种细胞因子的动态变化相似。结论:Pb PQ R系感染鼠脾细胞分泌的IFN-γ、IL-4及TNF-α随接种时间呈动态变化,其表达量与原虫率的高低有一定关系。

关键词：伯氏疟原虫哌喹抗性细胞因子 ELISPOT

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用pGAP启动子在***中组成型表达cbhⅡ基因

工业微生物 2010年第4期40卷 29-33页

作者：易国辉屠发志张爱联张添元屈直罗进贤中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室海口571101 海南大学农学院中山大学基因工程教育部重点实验室/生物化学系广州510275

用套叠PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因,以EcoR I和Not I双酶切将其克隆进***表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP-cbh Ⅱ。通过电转法将其cbhⅡ基因重组于***基因组,筛选高G418抗性的克隆作为工程菌。用葡萄糖作为碳源摇瓶发酵3 d,分泌的... 详细信息

用套叠PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因,以EcoR I和Not I双酶切将其克隆进***表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP-cbh Ⅱ。通过电转法将其cbhⅡ基因重组于***基因组,筛选高G418抗性的克隆作为工程菌。用葡萄糖作为碳源摇瓶发酵3 d,分泌的重组蛋白CBHⅡ达到50 mg/L。用CMC酶活法测定发酵液中的CMC酶活力为2.05 U/mL。

关键词：纤维素二糖水解酶毕赤酵母基因表达酶活力