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苏云金芽孢杆菌Cry毒素共性结构短肽串联表达及功能分析

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河南农业科学 2024年第1期53卷 96-104页

作者：金嘉凤沈成孟萌陈蔚徐重新刘媛刘贤金江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013 江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/省部共建国家重点实验室培育基地—江苏省食品质量安全重点实验室江苏南京210014 南京农业大学植物保护学院江苏南京210023 江苏大学生命科学学院江苏镇江212013

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Cry毒素是一类具有抗虫功能的微生物蛋白。将前期基于Bt Cry毒素家族氨基酸序列及结构信息设计获得的呈现Cry毒素共性结构的3个短肽,拼接成为具有免疫原性的长链多肽(Bt Cry-GXJG-11),以期研... 详细信息

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Cry毒素是一类具有抗虫功能的微生物蛋白。将前期基于Bt Cry毒素家族氨基酸序列及结构信息设计获得的呈现Cry毒素共性结构的3个短肽,拼接成为具有免疫原性的长链多肽(Bt Cry-GXJG-11),以期研发Bt Cry毒素杀虫功能的模拟物及制备Bt Cry毒素检测用广谱抗体的免疫原。分子建模预测结果显示,Bt Cry-GXJG-11与Bt Cry毒素靶标害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera)钙黏蛋白受体(HaCad-TBR)存在互作效应,并初步明确了两者互作的关键氨基酸位点为244TYR。经原核表达,获得了质量浓度为0.5 mg/mL的Bt Cry-GXJG-11纯蛋白,测得其与HaCad-TBR的亲和力常数(KD)为2.151×10^(-7)mol/L。室内生测试验表明,Bt Cry-GXJG-11对棉铃虫具有一定杀虫活性,校正死亡率为27.5%;且以其免疫的小鼠血清能同时识别6种Bt Cry毒素(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah、Cry1B、Cry1C、Cry1F)。

关键词： Bt Cry毒素共性结构分子互作杀虫活性广谱抗体棉铃虫

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小菜蛾杀虫抗体的对靶设计及验证

江苏农业学报 2024年第7期40卷 1212-1219页

作者：谢雅晶杨立应胡晓丹徐重新张霄高美静卢莉娜仲建锋朱庆刘媛刘贤金江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013 江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/农业农村部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室<南京>/江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所江苏南京210014 江苏农林职业技术学院江苏镇江212400

本研究拟通过模拟Cry毒素创制新型杀虫蛋白质用于小菜蛾防治,主要利用三维结构模拟及分子对接技术,以前期获得的抗Cry1Ab抗体为模板设计2个基因工程抗体(GEAb)。其中,具有杀虫活性的GEAb-GGCC与小菜蛾中肠刷状边缘膜囊泡(BBMV)具有较高... 详细信息

本研究拟通过模拟Cry毒素创制新型杀虫蛋白质用于小菜蛾防治,主要利用三维结构模拟及分子对接技术,以前期获得的抗Cry1Ab抗体为模板设计2个基因工程抗体(GEAb)。其中,具有杀虫活性的GEAb-GGCC与小菜蛾中肠刷状边缘膜囊泡(BBMV)具有较高结合活性,并与Cry1A和Cry1B具有重叠的BBMV结合位点。BBMV免疫沉淀分析鉴定结果显示,与GEAb-GGCC结合的中肠蛋白质包括氨肽酶N(APN)、V-ATP酶B亚基和polycalin。由于GEAb-GGCC缺乏Cry1A类蛋白质中负责成孔的α-螺旋结构,推测GEAb-GGCC或通过结合小菜蛾中肠受体激活下游信号通路,引起中肠损伤,导致虫体死亡。

关键词：对靶设计杀虫基因工程抗体分子对接小菜蛾 Cry毒素

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干杯

剧本 1991年第3期 78-79,70页

作者：徐重新

[幕启。台中一桌三椅,桌上摆着酒菜。台侧一屏风。小伟追着秀芬央求着上。小伟三姐,你还是为我说几句话哟。人家都说他只觑你,你一吼,他就脚粑手软……秀芬(眼一瞪)我又不是母老虎!小伟嘿,你是母老虎。人家说的,姐夫是个“粑耳朵”、“... 详细信息

[幕启。台中一桌三椅,桌上摆着酒菜。台侧一屏风。小伟追着秀芬央求着上。小伟三姐,你还是为我说几句话哟。人家都说他只觑你,你一吼,他就脚粑手软……秀芬(眼一瞪)我又不是母老虎!小伟嘿,你是母老虎。人家说的,姐夫是个“粑耳朵”、“妻管严”。秀芬“气管炎”,还“夫管炎哟”!小伟是“妻管严”!秀芬管严点不好?硬是要出了安全事故才好?小伟反正他只崇拜你。我的事不好明说,半夜三更,姐姐吹个“枕头风”嘛,肥水不流外人田唦!

关键词：你那你我三十岁十块钱给你气极管人受点五卜监测员

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商业银行如何提高经营效益

湖南经济 2003年第5期 43-44页

作者：徐重新

优化负债结构,向降低资金成本要效益一是改革目前存款指标考核体系.以同业存款市场占有率和当年新增存款占有率来考核和衡量存款工作的好坏,摈弃过去单纯考核增量和期末余额的管理模式.在年度筹资费用一定的情况下,调动一切积极因素,促... 详细信息

优化负债结构,向降低资金成本要效益一是改革目前存款指标考核体系.以同业存款市场占有率和当年新增存款占有率来考核和衡量存款工作的好坏,摈弃过去单纯考核增量和期末余额的管理模式.在年度筹资费用一定的情况下,调动一切积极因素,促进存款的较大增长.通过年度存款增量的攀升,降低年度筹资成本,提高经营效益.

关键词：商业银行经营效益负债结构资产结构资产质量中间业务市场开拓非盈利资产财务管理风险防范机制

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智慧社区房地产开发项目管理研究

智慧社区房地产开发项目管理研究

作者：徐重新大连海事大学

学位级别：硕士

在高速发展的中国,科技创新正在改变着人们的生活,提高人们的生活质量。怎么让国人享受到当今科技水平的成果呢?在社会主义初级阶段中,国人最希望的就是改善吃、住、行的问题,因此出现了智慧城市、智慧社区、智慧交通等新事物,它们改变... 详细信息

在高速发展的中国,科技创新正在改变着人们的生活,提高人们的生活质量。怎么让国人享受到当今科技水平的成果呢?在社会主义初级阶段中,国人最希望的就是改善吃、住、行的问题,因此出现了智慧城市、智慧社区、智慧交通等新事物,它们改变现在固有的生活状态,让人们确实能够享受科技进步给国人带来的舒适、安逸、快捷的生活。其核心方法是将物联网、网络通讯技术融入社区生活的各个环节当中,实现从家庭无线宽带覆盖、家居安防、家居智能、家庭娱乐,到小区智能化为一体的理想生活。本文首先综述了房地产项目管理的相关理论,介绍了房地产项目的概念、房地产项目管理的特点及内容、房地产项目管理的风险管理内容;在此基础上,阐述了智慧社区的概念及其房地产项目管理的内;然后就我国智慧社区房地产项目管理存在的问题进行了分析,并提出对策建议;最后,对某智慧社区项目管理案例进行了应用分析。本文是从项目管理的角度去研究的智慧社区,因此对于相关的技术如何在智慧社区的建设中发挥作用没有做更深入的研究,这也是今后进一步研究的方向。

关键词：智慧社区房地产项目管理对策

人源化抗苏云金芽孢杆菌Bt（CrylB）毒素蛋白单链抗体的筛选、表达及生物学活性测定

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人源化抗苏云金芽孢杆菌Bt（CrylB）毒素蛋白单链抗体的筛选、表...

作者：徐重新南京师范大学

学位级别：硕士

针对转Bt毒素蛋白基因抗虫植物及Bt毒素蛋白制剂的应用在的生态安全风险以及对人类和其它哺乳动物的安全隐患,课题以Bt Cry1B毒素蛋白为对象,从人源化Tomlinson J噬菌体抗体库中筛选具有Cry1B毒素蛋白结合活性的噬菌体单链抗体,并进行... 详细信息

针对转Bt毒素蛋白基因抗虫植物及Bt毒素蛋白制剂的应用在的生态安全风险以及对人类和其它哺乳动物的安全隐患,课题以Bt Cry1B毒素蛋白为对象,从人源化Tomlinson J噬菌体抗体库中筛选具有Cry1B毒素蛋白结合活性的噬菌体单链抗体,并进行可溶性表达,建立了Cry1B毒素蛋白的酶联免疫吸附技术(Enzyme Linked Immunosourbent Assay,ELISA)和时间分辨荧光免疫分析存技术(Time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)免疫学检测方法。经4轮富集筛选并鉴定,成功筛选获得8个具有Cry1B毒素蛋白结合活性的阳性噬菌体单链抗体菌株,其差异主要存在于单链抗体的CDR区氨基酸。取1E2号噬菌体单链抗体菌株(ELISA值最高)做为可溶性表达材料,通过宿主替换的方式重组噬菌体单链抗体基因至*** HB2151宿主细胞中进行可溶性表达,纯化抗体蛋白并检测活性。***电泳及基因测序等结果证实重组噬菌体对*** HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白浓度为132μg/mL。在培养温度30℃,1m mol/L IPTG诱导条件下,单链抗体在*** HB2151宿主中的最佳诱导表达时间为12h。将1E2号重组噬菌体单链抗体基因克隆导入pFastBacTMHT-A载体,构建pFastBacTMHT-A-scFv重组质粒,化转***感受态细胞,进行蓝白斑筛选,提取白斑菌落中的重组Bacmid-scFv杆状病毒质粒侵染sf9昆虫细胞,进行真核表达,纯化抗体蛋白并检测活性。实验结果表明pFastBacTMHT-A-scFv重组质粒构建成功,阳性克隆菌株中存在完整、正确单链抗体基因;重组Bacmid-scFv杆状病毒质粒侵染sf9昆虫细胞后,细胞发生明显病变特征,ELISA、SDS-PAGE及Western blotting检测均证实单链抗体蛋白在昆虫细胞中表达成功,纯化后测定其表达量为103μg/mL。分别以三种形式的单链抗体建立针对Cry1B毒素蛋白的间接竞争性ELISA法测,以原核表达的单链抗体和抗CrylB多抗作为检测抗体建立针对CrylB毒素蛋白的双抗夹心TRFIA检测方法。经抗原的间接竞争ELISA法测定：Cry1B毒素蛋白对融合形式单链抗体的抑制中浓度(IC50)为1.075μg/mL,最低检测线IC0为13.4ng/mL,线性检测范围在0.5～4.0μg/mL之间;对原核表达单链抗体的抑制中浓度(IC50)为1.398μg/mL,最低检测限(IC10)为25.7ng/mL,线性检测范围为0.5～4.0μg/mL对真核表达单链抗体的抑制中浓度(IC50)为1.010μg/mL最低检测线(IC10)为11.3ng/mL,线性检测范围为0.5～10.0μg/mL。用原核表达的单链抗体建立针对Cry1B毒素蛋白TRFIA的检测方法显示,标准检测曲线灵敏度为0.17ng/mL,线性测量范围在1.0-800ng/mL,无抗原类似物的交叉反应。结论：本试验以真核系统表达的单链抗体建立的间接竞争性ELISA检测方法和以原核系统表达的单链抗体建立的双抗夹心TRFIA检测方法,在抗原检测灵敏度上均已接近商品化试剂盒的检测要求,这为后期开发具有针对Cry1B毒素蛋白快速检测试剂盒提供了条件。

关键词：苏云金芽孢杆菌 Cry1B毒素蛋白噬菌体抗体库可溶性表达酶联免疫吸附技术时间分辨荧光免疫分析技术

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Bt Cry毒素抗虫模拟物靶向创新设计

生物工程学报 2023年第2期39卷 446-458页

作者：徐重新刘媛张霄刘贤金江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室江苏南京210014

Bt Cry毒素是当前研究最深入、应用最广的生物抗虫蛋白,对农业害虫的绿色防治发挥了重大作用。然而,随着其制剂和转基因抗虫作物的广泛应用,由此驱动诱发的靶标害虫抗药性及潜在生态安全风险等问题日益凸显。探寻具备模拟Bt Cry毒素杀... 详细信息

Bt Cry毒素是当前研究最深入、应用最广的生物抗虫蛋白,对农业害虫的绿色防治发挥了重大作用。然而,随着其制剂和转基因抗虫作物的广泛应用,由此驱动诱发的靶标害虫抗药性及潜在生态安全风险等问题日益凸显。探寻具备模拟Bt Cry毒素杀虫功能的新型抗虫蛋白材料,不仅可为农作物持续健康生产保驾护航,也能在一定程度上缓解靶标害虫对Bt Cry毒素的抗药性压力。近年来,笔者团队以抗体“免疫网络学说(immune network theory)”中Ab2β类型抗独特型抗体(anti-idiotype antibody, Anti-Id)具备模拟抗原结构和功能的特性为理论依据,借助噬菌体展示抗体库及特异性抗体高通量筛选与鉴定技术,设计Bt Cry毒素抗体为包被靶点抗原,从噬菌体抗体库中靶向筛选到了一系列具备模拟Bt Cry毒素抗虫功能的Ab2β类型抗独特型抗体(即Bt Cry毒素抗虫模拟物),其中活性最强的Bt Cry毒素抗虫模拟物对靶标害虫的致死率接近相应原Bt Cry毒素的80%,初步实现了Bt Cry毒素抗虫模拟物的靶向设计。本文从理论依据、技术条件、研究现状等方面进行系统概述,并就相关技术发展趋势以及如何推进现有成果落地应用等展开深入探讨,旨在为绿色抗虫材料创新研发提供全新思路和实例参考。

关键词： Bt Cry毒素抗独特型抗体噬菌体展示抗体抗虫蛋白生物防治

人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定

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南京农业大学学报 2013年第3期36卷 47-52页

作者：徐重新张存政张霄刘媛黄鹰刘贤金江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室江苏南京210014 南京师范大学生命科学学院/江苏省微生物与功能基因组学重点实验室江苏南京210023

利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染*** HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在*** HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性,通过时间梯度优化获得可溶性表达蛋白的最佳培养时间。结果表明:经PCR、DNA电泳及基因测序等,均证实重组噬菌体对*** HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE电泳结果表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白质量浓度为132μ***-1。以纯化的scFv蛋白为基础建立了对Cry1B毒素蛋白的间接竞争ELISA法,方法的抑制中质量浓度(IC50)为1.398μ***-1,最低检测限(IC10)为0.025 7μ***-1,线性检测范围为0.5～5.0μ***-1,scFv对Cry1C的交叉反应率为7.51%;与Cry1Ab、Cry1Ac的交叉反应率均小于0.1%;在培养温度30℃,1 mmol.L-1IPTG诱导条件下,scFv在***2151宿主中的最佳诱导表达时间为12 h。本研究成功地将抗Cry1B毒素蛋白的scFv在*** HB2151中进行了可溶性表达,获得了具有抗原结合活性的scFv融合型抗体,为实际生产应用与试剂盒研发提供了基础。

关键词： Cry1B毒素蛋白单链抗体可溶性表达抗原结合活性

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建筑施工质量管理

科技风 2009年第3期 13-,15页

作者：徐重新沈阳市自来水大东营业处辽宁沈阳110042

施工项目由于具有产品固定,生产流动,产品多样,结构类型不一,露天作业多,自然条件(地质、水文、气象、地形等)多变,材料品种、规格不同,材性各异,交叉施工,现场配合复杂,工艺要求不同,技术标准不一等特点,因此,对质量影响的因素繁多,在... 详细信息

施工项目由于具有产品固定,生产流动,产品多样,结构类型不一,露天作业多,自然条件(地质、水文、气象、地形等)多变,材料品种、规格不同,材性各异,交叉施工,现场配合复杂,工艺要求不同,技术标准不一等特点,因此,对质量影响的因素繁多,在施工过程中稍有疏忽,就极易引起系统性因素的质量变异,而产生质量问题或严重的工程质量事故。

关键词：施工质量项目管理特点