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CD80鼠—人嵌合抗体的构建、表达及生物学功能的初步研究

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CD80鼠—人嵌合抗体的构建、表达及生物学功能的初步研究

作者：徐耀瑜苏州大学

学位级别：硕士

本研究在自行成功研制的鼠抗人CD80阻断型单克隆抗体(4E5)的基础上,采用嵌合抗体构建方法,在真核细胞CHO中实现稳定表达,并对嵌合抗体生物学功能进行初步研究。第一部分:CD80鼠-人嵌合抗体的构建及表达从4E5杂交瘤细胞中抽取总RNA,常... 详细信息

本研究在自行成功研制的鼠抗人CD80阻断型单克隆抗体(4E5)的基础上,采用嵌合抗体构建方法,在真核细胞CHO中实现稳定表达,并对嵌合抗体生物学功能进行初步研究。第一部分:CD80鼠-人嵌合抗体的构建及表达从4E5杂交瘤细胞中抽取总RNA,常规逆转录,应用简并引物进行PCR扩增。根据重、轻链基因序列设计引物,应用SMART-PCR方法扩增含信号肽序列的V和V基因。同时用特异性引物从pIRES/hu5C11质粒中扩增人IgG1γ链的Fc、CH1及κ链的Cκ基因。再利用TP-PCR方法分别将Fc、CH1和含信号肽序列的V序列进行拼接得到嵌合重链,Cκ与含信号肽序列的V序列进行拼接获得嵌合轻链。构建共表达嵌合重、轻链的重组质粒pIRES/ch4E5。pIRES/ch4E5重组质粒用脂质体法转染293T细胞,经FCM检测培养上清中嵌合抗体的瞬时表达后,再转染CHO细胞,经G418加压筛选,获取持续稳定分泌嵌合抗体的CHO-ch4E5细胞。研究结果表明:成功构建了含嵌合重、轻链基因的真核表达载体pIRES/ch4E5,并分别在293T及CHO细胞中得到瞬时表达及稳定表达。第二部分:CD80鼠-人嵌合抗体生物学功能的初步研究大量收集CHO-ch4E5细胞无血清培养上清,经protein G亲和层析法纯化及Lowry法定量,SDS-PAGE鉴定嵌合抗体的纯度及分子量,FCM分析嵌合抗体对多种肿瘤细胞Daudi、SH2-1及U937等细胞膜型CD80分子的识别。选择天然高表达CD80分子的人B淋巴瘤细胞株Daudi(阳性表达率＞90%)与ch4E5(终浓度为10μg/ml)共培养,MTT和FCM分析ch4E5对Daudi细胞的生长与存活的影响。采用竞争抑制法分析ch4E5与母本抗体的竞争抑制作用及MTT对MLR的影响作用。ELISA检测ch4E5与PBLs共培养后IL-2、INF-γ及IL-10的水平。结果表明:CHO-ch4E5细胞培养上清中嵌合抗体的得率为4～5.8 mg/L。ch4E5能够与4E5相互竞争抑制抗原抗体结合,并有效识别Daudi细胞膜型CD80分子(结合率为95.5%)。ch4E5能有效抑制Daudi细胞体外增殖(P=0.000067＜0.05),并诱导其凋亡。ch4E5抑制PBLs体外增殖(P=0.000012＜0.05),下调分泌IL-2(P=0.000156＜0.05)及INF-γ(P=0.000001＜0.05),上调分泌IL-10(P=0.000035＜0.05)。提示CD80嵌合抗体具有良好的生物学活性。本研究获得的成果:1、成功构建了抗人CD80鼠-人嵌合抗体(ch4E5)真核表达质粒。2、获得了稳定分泌嵌合抗体的细胞株CHO-ch4E5及相应的纯品抗体。3、CD80嵌合抗体可有效抑制天然高表达CD80分子的人B淋巴瘤细胞株Daudi的体外增殖;抑制混合淋巴细胞反应。该抗体在某些肿瘤的免疫治疗及移植抗排异中具有潜在的应用价值。

关键词： CD80 嵌合抗体真核细胞协同刺激信号

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CAR-T细胞治疗进展综述

CAR-T细胞治疗进展综述

第十一届全国免疫学学术大会

作者：徐耀瑜 Peking Union Medical College

嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)是由抗体靶向区与T细胞信号区融合而成,当T细胞表达CAR后赋予T细胞新的抗原特异性。第1代CAR仅含有一个信号单元,主要来自于CD3ζ或者Fc Rg亚单位;第2代CAR在第1代CAR基础上引入1个共刺... 详细信息

嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)是由抗体靶向区与T细胞信号区融合而成,当T细胞表达CAR后赋予T细胞新的抗原特异性。第1代CAR仅含有一个信号单元,主要来自于CD3ζ或者Fc Rg亚单位;第2代CAR在第1代CAR基础上引入1个共刺激分子,建立T细胞受体与配体相结合的共刺激路径;2个CD28及4-1BB、CD3ζ偶联形成的第3代CART可增强T细胞的杀瘤能力,延长T细胞在体内的存活时间;最新的第4代CAR在之前基础上增加了细胞因子的表达。基于双信号途径,当CAR与MHC-抗原肽复合体结合后,同时与CD3结合形成复合体后,引起ITAM磷酸化激活下游蛋白使CAR-T细胞活化增殖转变为CTL细胞,对含有肿瘤抗原的肿瘤细胞进行免疫攻击。CAR-T细胞针对的主要靶标有:免疫分子CD19,在腺癌中过表达的跨膜表皮生长因子受体家族成员HER-2,具有促进原发及转移肿瘤生长作用的神经节苷脂2(GD2),在胰腺癌中高表达的间皮素,表达于急性髓细胞白血病细胞表面的CD123,及新的肿瘤靶点硫酸软骨素蛋白多糖-4和L1细胞粘附分子的CE7表位。迄今为止,除了针对B细胞恶性肿瘤的临床试验获得成功外,还有一些关于卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌的CAR-T试验。细胞免疫疗法的不良反应,包括CAR-T细胞针对正常组织的脱靶效应,对机体内大量细胞因子的激活作用,研究者又设计了多种人工调节策略规避潜在风险,如使用两种不同CAR,只有当二者与肿瘤靶抗原都结合后才能完全应答,以优化CAR-T细胞治疗实体瘤。本文将综述CAR结构,CAR-T细胞抗肿瘤原理,CAR-T细胞在临床上的应用及不良反应,和CAR-T免疫治疗最新进展。

关键词： CAR 肿瘤治疗 T细胞

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FFPE中肽段样本制备的比较研究

FFPE中肽段样本制备的比较研究

中国生物化学与分子生物学会2020全国学术在线会议

作者：徐耀瑜司伟杰马军岩吴汉夔安阳师范学院国际化学与药物科学研究室河南安阳

经福尔马林固定的石蜡包埋组织(Formalin-fixed and paraffin-embedding,FFPE)是临床组织保存的主要形式,是肿瘤研究的重要对象。随着近十年来蛋白质组学技术和质谱检测的快速发展,正在开展基于大规模FFPE样本的研究工作。本研究中以FFP... 详细信息

经福尔马林固定的石蜡包埋组织(Formalin-fixed and paraffin-embedding,FFPE)是临床组织保存的主要形式,是肿瘤研究的重要对象。随着近十年来蛋白质组学技术和质谱检测的快速发展,正在开展基于大规模FFPE样本的研究工作。本研究中以FFPE样本和新鲜样本为比较对象,通过循环的高压高温操作,提取组织内蛋白质样本,制备后续的质谱肽段,进行质谱分析。从FFPE样本和新鲜组织样本中,提取得到的肽段情况分析后,新鲜组织的5个样本共提取肽段数目10032,包含1532个磷酸化肽段,对应3534个蛋白质;FFPE组织的5例样本共分析到8598个肽段,其中1092个磷酸化肽段,找到3299个蛋白质。经过比较,来源相同组织样本但不同保存状态下,蛋白质被识别情况相似程度为87.32%。两种样本保存状态下的蛋白质数量、肽段数量及磷酸化肽段数量均无显著性差异。FFPE样本可以较好的追溯和分析肿瘤成因,结合临床信息优化现有诊断和治疗。

关键词： FFPE 新鲜组织肽段制备磷酸化肽段质谱分析

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生物素化蛋白质的特异性质谱分析研究

生物素化蛋白质的特异性质谱分析研究

抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达

河南省化学会2020年学术年会

作者：徐耀瑜马军岩司伟杰吴汉夔刘林安阳师范学院化学化工学院

识别修饰蛋白质是分析化学中的重要研究内容之一,通过生物素化蛋白质的质谱分析,可以了解蛋白质功能和相互结合的具体情况。传统方案是通过亲和素将生物素肽段结合后进行串联质谱分析,但亲和素和生物素的亲和力过高,难以洗脱和释放结合... 详细信息

识别修饰蛋白质是分析化学中的重要研究内容之一,通过生物素化蛋白质的质谱分析,可以了解蛋白质功能和相互结合的具体情况。传统方案是通过亲和素将生物素肽段结合后进行串联质谱分析,但亲和素和生物素的亲和力过高,难以洗脱和释放结合的生物素化赖氨酸残基位点,从而产生假信号。特异性方案为生物素抗体富集生物素化肽段,并能够洗脱和暴露赖氨酸残基位,同时保留的生物素印记被串联质谱检测和分析得到对应蛋白质信息。通过此改进方案,我们确认了HEK293T细胞中存在天然生物素化修饰的22种蛋白质,表达KRAS-生物素酶的HEK293T细胞内存在1872种蛋白质可能与KRAS发生相互作用。该研究更加准确的定位了生物素化蛋白质,缩小了验证目标,加快了关键蛋白质的分析。

关键词：生物素化赖氨酸质谱分析

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复旦学报（医学版） 2007年第4期34卷 482-485页

作者：程钢陈永井马震宇费敏孙中文徐耀瑜胡玲玲邱玉华苏州大学医学生物技术研究所苏州215007 苏州大学生化工程研究所苏州215007

目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:2F5)中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构... 详细信息

目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:2F5)中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5。转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养。采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况。结果抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合。结论抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础。

关键词： CD28 单克隆抗体嵌合抗体瞬时表达

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数字媒介认识论之辨:阐释、偏离与改进

中国出版 2024年第5期 46-48页

作者：徐耀铎西安交通大学马克思主义学院

数字媒介作为当代技术发展所催发的客观的新生事物,从物质技术和思维两个面向制约着人类认识世界的方式。数字媒介拓宽了主体对客体的认知边界,延伸了实践与认识的耦合关系,但算法工具理性的异化和人工智能主体性的缺失仍在制约人类认... 详细信息

数字媒介作为当代技术发展所催发的客观的新生事物,从物质技术和思维两个面向制约着人类认识世界的方式。数字媒介拓宽了主体对客体的认知边界,延伸了实践与认识的耦合关系,但算法工具理性的异化和人工智能主体性的缺失仍在制约人类认识水平的进步。文章旨在重新认识数字媒介应正视人与数字媒介的区别,明确数字媒介的工具属性和定位,了解算法技术的风险与威胁,纠正对人工智能的偏信与盲从,实现人与数字媒介共生。

关键词：数字媒介认识论认识纠偏

125^I标记抗人CD40 mAb 5H6在荷人卵巢癌(HO8910)BALB/c裸鼠体内分布及放射免疫显像

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中国免疫学杂志 2008年第6期24卷 533-537页

作者：罗先富章斌马泓冰汤琳郑舒丹徐耀瑜吴翼伟张学光苏州大学医学生物技术研究所江苏省医学临床免疫学重点实验室苏州215007 苏州大学附属第一医院核医学科苏州215006

目的:研究125I标记抗人CD40单克隆抗体(mAb)5H6同卵巢癌细胞HO8910体外结合的生物学特性以及在荷瘤鼠体内的分布和放射免疫显像。方法:氯胺-T法进行mAb 5H6 125I标记(125I-5H6),Lindmo法计算125I-5H6的免疫活性分数;细胞结合饱和实验进... 详细信息

目的:研究125I标记抗人CD40单克隆抗体(mAb)5H6同卵巢癌细胞HO8910体外结合的生物学特性以及在荷瘤鼠体内的分布和放射免疫显像。方法:氯胺-T法进行mAb 5H6 125I标记(125I-5H6),Lindmo法计算125I-5H6的免疫活性分数;细胞结合饱和实验进行Scatchard分析计算解离常数Kd及最大结合位点数Bmax;建立荷人卵巢癌(HO8910)裸鼠模型,分析125I-5H6在体内的分布,并用SPECT进行放射免疫显像。结果:mAb 5H6标记率为(85.4±5.2)%,放射化学纯度为(99.2±0.5)%,125I-5H6免疫活性分数为(38.6±5.4)%,与HO8910细胞的亲和力Kd=(0.711±0.06)nmol/L。在荷瘤鼠体内特异性结合HO8910肿瘤,48小时达到高峰,放射免疫显像肿瘤清晰可见。结论:125I-5H6同卵巢癌HO8910细胞在体外结合具有很高亲和力,在体内能特异性结合HO8910肿瘤,能获得优质的放射免疫图像。

关键词： 125^I标记氯胺-T法 CD40 放射免疫显像卵巢癌单克隆抗体

苯乙烯-马来酸酐共聚物的改性及其染料吸附性能研究

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苯乙烯-马来酸酐共聚物的改性及其染料吸附性能研究

作者：徐耀齐鲁工业大学

学位级别：硕士

苯乙烯-马来酸酐共聚物（SMA）具有疏水性苯乙烯结构和反应性酸酐基团,具有良好的生物相容性,是一种潜在的吸附骨架材料,但强疏水性使它在水溶液中的分散性差,容易发生团聚,限制了其应用。因而,通过对SMA进行改性,在其表面接枝亲水性官... 详细信息

苯乙烯-马来酸酐共聚物（SMA）具有疏水性苯乙烯结构和反应性酸酐基团,具有良好的生物相容性,是一种潜在的吸附骨架材料,但强疏水性使它在水溶液中的分散性差,容易发生团聚,限制了其应用。因而,通过对SMA进行改性,在其表面接枝亲水性官能团或设计改变其自身官能团,使其作为疏水性组份和骨架聚合物通过物理或化学交联作用负载亲水性功能吸附组份,以克服吸附组份水溶性的缺点,便于吸附后的分离回收。本文设计制备了两种以SMA为载体的吸附剂,分别为粉体聚乙烯亚胺接枝苯乙烯-马来酸酐共聚物（PEI-SMA）和块体聚乙烯亚胺-（苯乙烯-马来酸酐共聚物）气凝胶（PEI-SMA Aerogel）,并用于吸附阴离子染料。具体研究内容如下:（1）通过一步酰胺化反应将聚乙烯亚胺接枝到苯乙烯-马来酸酐共聚物上,制备了PEI-SMA吸附剂。优化PEI/SMA的合成比例,以提高PEI在SMA上的接枝密度,PEI/SMA的最佳合成比例为3:1。通过静态吸附实验,系统研究了可能影响PEI-SMA吸附活性黑5（RB5）的各种因素,如p H值、吸附剂用量、接触时间、染料浓度和温度等。PEI-SMA对RB5的吸附过程符合Langmuir等温线模型和拟二级动力学模型,表明其为单层化学吸附。p H=2时,PEI-SMA对RB5染料的实验吸附容量为1749.19 mg g,去除率为99.86%。此外,PEI-SMA对共存的Cl和SO离子以及阳离子染料孔雀石绿（MG）表现出高效的RB5选择性吸附。对其吸附机理的研究表明,静电作用、π-π作用和氢键为主要吸附驱动力。（2）以苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙烯亚胺和1,4-丁二醇二缩水甘油醚为原料,采用冰模板法制备了一种具有共价/非共价双重交联网络的聚乙烯亚胺-（苯乙烯-马来酸酐共聚物）气凝胶（PSA）,用于吸附废水中的阴离子染料。PSA为片状堆积结构,具有良好的膨胀性能和耐酸碱稳定性。系统地考察了不同染料浓度、吸附剂质量、时间、温度和p H条件下PSA对RB5染料的吸附行为。PSA对RB5的吸附过程符合Langmuir等温线模型和拟二级动力学模型,说明其为单层化学吸附,在p H=2时的最大理论吸附容量为1822.99 mg g（308 K）。PSA对阴离子染料刚果红（CR）和甲基橙（MO）也展现了高的吸附容量,实验吸附量分别为1653.98和780.36 mg g（p H=5）。机理研究表明,静电作用、π-π作用和氢键是主要吸附机制。此外,相比PEI-SMA粉体吸附剂,块体PSA对阴离子染料具有更好的吸附选择性、抗盐干扰性能和再生循环吸附性能。经过3次再生循环后,PSA的吸附效率仍保持在95.3%。

关键词：苯乙烯-马来酸酐共聚物改性染料吸附

转染人CTLA-4细胞的对树突状细胞B7分子表达的影响

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现代免疫学 2007年第4期27卷 289-293页

作者：孙玮丽陈永井孙中文徐耀瑜胡玲玲张学光邱玉华苏州大学生物技术研究所苏州215007

从PHA活化的人外周血T细胞中抽提总RNA,经RT-PCR扩增出CTLA-4的全长基因,构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4,经PCR及电泳鉴定后感染包装细胞293T。收集培养上清感染L929细胞。用Zeocin选择培养。经免疫荧光及流式细胞术进行筛选,获取... 详细信息

从PHA活化的人外周血T细胞中抽提总RNA,经RT-PCR扩增出CTLA-4的全长基因,构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4,经PCR及电泳鉴定后感染包装细胞293T。收集培养上清感染L929细胞。用Zeocin选择培养。经免疫荧光及流式细胞术进行筛选,获取稳定表达CTLA-4分子的细胞株CTLA-4/L929。将CTLA-4/L929经丝裂霉素处理后与体外细胞因子诱导的树突状细胞共同孵育。分别于24、48及72h,用直接免疫荧光法和流式细胞术分析树突状细胞B7-1和B7-2分子的表达。研究结果显示,构建的重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4的PCR产物长约700 bp,与人CTLA-4基因的长度一致。经Zeocin选择及多次亚克隆化培养,CTLA-4基因转染细胞CTLA-4/L929稳定表达膜型CTLA-4分子。以其为刺激细胞与树突状细胞共同培养后,可明显下调树突状细胞B7-1的表达,但对B7-2的表达没有影响。本研究获得的CTLA-4基因转染细胞株,为进一步探讨CTLA-4及其配基分子在免疫应答中的作用与机制提供了手段。

关键词： CTLA-4 B7 基因转染共刺激分子树突状细胞表达