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猪瘟病毒E2糖蛋白分泌型表达载体的构建及其免疫效果研究

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猪瘟病毒E2糖蛋白分泌型表达载体的构建及其免疫效果研究

作者：徐彦召西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪瘟（Classical swine fever ,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）,引起的猪的一种高度接触性传染病,本病给世界的养猪业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫在猪瘟的防控中起到了关键作用,特别是中国研制成功的猪瘟... 详细信息

猪瘟（Classical swine fever ,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）,引起的猪的一种高度接触性传染病,本病给世界的养猪业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫在猪瘟的防控中起到了关键作用,特别是中国研制成功的猪瘟兔化弱毒疫苗,给中国乃至世界范围内猪瘟的防控起到了积极作用。该疫苗也存在不足之处,如不能区分机体产生的抗体是由疫苗免疫引起的还是感染野毒引起的,故而影响了国际间的猪和猪肉的贸易。因此,开发具有鉴别意义的猪瘟基因工程疫苗势在必行。本研究构建了表达CSFV石门株E2基因的分泌型真核表达载体和重组腺病毒表达载体pAd-lgk-E2sh,并将其在永生化的猪血管内皮细胞中分泌表达,对收集到的目的蛋白进行初步定量并进行小鼠免疫试验,为研制猪瘟基因工程亚单位疫苗奠定基础。 1.表达CSFV E2基因和E2去除跨膜区基因真核分泌型的的构建及鉴定。首先用PCR方法分别从pMD-19T-E2质粒中扩增出E2基因全长序列（E2qc）和E2基因去除跨膜区的基因序列（E2sh）,分别将其克隆入真核分泌型表达载体pSec-Tag 2（A）中,成功构建pSec-Tag-E2qc和pSec-Tag-E2sh。分别通过脂质体转染的方法将构建好的阳性载体使其在永生化的猪脐静脉血管内皮细胞中表达,经SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白的表达量和活性,结果显示,去除E2基因跨膜区序列的真核表达载体转染细胞成功地将目的蛋白分泌到培养基中,并能与猪瘟阳性血清相结合。 2.表达CSFV E2基因的重组腺病毒pAd-lgk-E2的构建及鉴定。首先用PCR方法从pSec-Tag-E2sh质粒中扩增出lgk-E2基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建出重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack- lgk-E2。用PmeⅠ内切酶对pAdTrack-lgk-E2质粒酶切线性化,回收酶切产物以后转化含有腺病毒骨架载体pAdEasier-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中使穿梭载体和骨架载体发生同源重组,得到含有lgk-E2基因的pAdTrack-lgk-E2。之后用Pac I内切酶线性化pAdTrack-lgk-E2,回收后通过脂质体介导法将骨架载体转染HEK293细胞,获得了含有目的基因的重组腺病毒pAd-lgk-E2。用同样的方法制备对照空载体腺病毒pAd-CMV。该重组病毒能在293细胞上产生典型的细胞病变和表达绿色荧光蛋白。RT-PCR检测结果表明lgk-E2基因被成功转录,感染永生化的猪脐静脉血管内皮细胞后,SDS-PAGE和Western blot显示目的基因成功表达,并具有很好的反应原性。 3.表达的CSFV E2蛋白的小鼠免疫试验。将收集到的含有目的蛋白的细胞上清液用超低温冷冻干燥处理的方法初步估算出E2蛋白的表达量约为100μg/ mL。将24只Balb/c小鼠随机分为6组,每组4只,经腹腔和肌肉注射3个不同抗原含量的免疫原,同时设阳性,阴性和空白对照,经2次免疫后用猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒检测抗体。结果表明,通过2次免疫后小鼠产生了针对CSFV的特异性抗体,抗体滴度最高可达1∶1 500。

关键词：猪瘟病毒 E2基因分泌表达抗体检测

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的遗传稳定性分析及滴度测定

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中国生物工程杂志 2010年第9期30卷 19-23页

作者：王青胡建和徐彦召河南科技学院动物科学学院新乡453003 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

研究表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒pAd-H5的遗传稳定性及重组病毒的滴度测定。将重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15和20代的重组病毒采用PCR方法扩增禽流感病毒HA基因,并进行基因序列测定分析;用标记为... 详细信息

研究表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒pAd-H5的遗传稳定性及重组病毒的滴度测定。将重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15和20代的重组病毒采用PCR方法扩增禽流感病毒HA基因,并进行基因序列测定分析;用标记为GFP的快速测定法计算出20代次时重组病毒的滴度。从各代重组病毒DNA中均扩增出了约1700bp的目的条带,与HA基因片段长度一致,基因序列分析表明:第5、10、15代重组病毒中的HA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有1处发生了点突变(即HA基因417位A→G),但其编码的氨基酸未发生变化(即同义突变),表明表达的目的蛋白抗原表位未发生变化;计算出的重组病毒滴度为108.875pfu/0.1ml。重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,具有良好的遗传稳定性,重组腺病毒的病毒滴度相对较高。

关键词： H5N1亚型禽流感重组腺病毒遗传稳定性病毒滴度

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《动物免疫学实验技术》课程教学改革

家畜生态学报 2014年第3期35卷 89-92页

作者：徐彦召胡建和河南科技学院动物科学学院河南新乡453003

结合河南科技学院硕士研究生动物免疫学实验技术课教学现状,从教学内容、教学手段、教学考核等方面探讨动物免疫学实验技术课程教学改革,通过开展以课题研究为模式,综合运用免疫学实验技术的实验课教学方法,培养研究生独立思考问题以及... 详细信息

结合河南科技学院硕士研究生动物免疫学实验技术课教学现状,从教学内容、教学手段、教学考核等方面探讨动物免疫学实验技术课程教学改革,通过开展以课题研究为模式,综合运用免疫学实验技术的实验课教学方法,培养研究生独立思考问题以及系统性科研设计的意识,进而将学到的免疫学实验技术知识用以解决实际问题,最终提高硕士研究生动物免疫学实验技术课程的教学质量。

关键词：动物免疫学实验技术教学改革硕士研究生

猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112弱毒株NSP2区表达猪瘟病毒E2基因表位的研究

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病毒学报 2013年第1期29卷 17-25页

作者：徐彦召周艳君童武李玲姜一峰童光志中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 河南科技学院动物科学学院新乡453003

建立共表达猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV)E2蛋白主要中和性抗原表位基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,为进一步研究PRRSV作为病毒载体提供实验数据。本研究在PRRSVHuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础... 详细信息

建立共表达猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV)E2蛋白主要中和性抗原表位基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,为进一步研究PRRSV作为病毒载体提供实验数据。本研究在PRRSVHuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因插入HuN4-F112弱毒株PRRSV已鉴定出的两个NSP2蛋白的复制非必需区,经基因片段的克隆、拼接,构建了两株含有CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因的感染性PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ508-532+E2和psk-HuN4-F112-Δ480-532+E2。用限制性内切酶SwaΙ分别将两株共表达的感染性克隆线性化,之后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法分别将病毒RNA转染BHK-21细胞包装出病毒粒子,再分别将其转接到MARC-145细胞传代拯救出两株病毒。分别对两株拯救病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,两株拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(拯救病毒基因组的14 667位因同义突变产生的MluⅠ酶切位点)和插入基因序列。间接免疫荧光试验表明,CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因均能在两株拯救的PRRSV中表达,且能够在其传代过程中稳定遗传。病毒生长特性结果比较显示两株拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了两株共表达CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因的PRRSV感染性克隆并获得了拯救病毒,且外源基因能在拯救病毒中稳定表达,为进一步开发新型PRRSV二联疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA 拯救病毒病毒载体

利用CMV启动子构建PRRSV感染性克隆的研究

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2016年第7期44卷 50-56,63页

作者：徐彦召王青胡建和余娟陈仕均河南科技学院动物科学学院河南新乡453003

【目的】建立一种利用CMV启动子获得拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒提供操作平台。【方法】根据PRRSV的基因序列特征和CMV启动子的序列特征,对pBluescprictⅡSK(+)载体进行多克隆序列改造... 详细信息

【目的】建立一种利用CMV启动子获得拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒提供操作平台。【方法】根据PRRSV的基因序列特征和CMV启动子的序列特征,对pBluescprictⅡSK(+)载体进行多克隆序列改造;设计特异性引物,分6段扩增、组装出PRRSV的全长cDNA并扩增CMV真核启动子序列;采用酶切、连接、转化等方法将连接成功病毒的全长cDNA置于CMV真核启动子序列的下游,获得含有CMV启动子和猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株全长cDNA克隆的重组质粒pSK-CH-1A;再将重组质粒直接转染MARC-145宿主细胞,得到猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株病毒的拯救病毒。【结果】成功获得了19 112bp含CH-1A全长cDNA的pSK-CH-1A载体,将其直接转染MARC-145宿主细胞后,经细胞体内转录合成病毒基因组RNA,获得了拯救病毒(rCH-1A);病毒生长特性试验结果显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性,且拯救病毒序列含有不同于亲本病毒的分子标记MluⅠ酶切位点。【结论】建立了一种方法简单,操作方便,节约时间和成本的PRRSV感染性cDNA克隆的体外拯救方法。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 CMV启动子感染性克隆

共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

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病毒学报 2010年第5期26卷 385-391页

作者：何雷张彦明徐彦召唐青海王静杨小云代晨向华常鹏祥林鸷西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

为研制猪瘟活载体疫苗,构建共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒并研究其免疫原性。应用PCR方法从pMD19-T-E2质粒和pMD19-T-pIL2质粒中分别扩增E2基因和pIL-2基因,将扩增的全长E2基因和pIL-2的编码区基因序列通过柔性... 详细信息

为研制猪瘟活载体疫苗,构建共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒并研究其免疫原性。应用PCR方法从pMD19-T-E2质粒和pMD19-T-pIL2质粒中分别扩增E2基因和pIL-2基因,将扩增的全长E2基因和pIL-2的编码区基因序列通过柔性接头序列(5个甘氨酸密码子)串联,插入腺病毒穿梭载体AdTrack中,在受体菌中与骨架载体AdEasy同源重组。重组质粒AdEasy-E2-pIL-2转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒rAd-E2-pIL-2。用rAd-E2-pIL-2免疫家兔,经兔体交互免疫试验评定其免疫效果。结果显示,经RT-PCR和West-ern blot检测,成功构建了rAd-E2-pIL-2,重组病毒滴度达108.12PFU/mL。rAd-E2-pIL-2接种家兔后刺激接种兔产生猪瘟病毒特异性抗体,淋巴细胞转化试验结果显示猪瘟病毒诱导兔淋巴细胞特异性增殖,攻毒后rAd-E2-pIL-2接种兔和猪瘟病毒C株接种兔均未出现定型热反应。研究结果表明,rAd-E2-pIL-2免疫兔可以预防猪瘟病毒C株接种引发的体温反应,rAd-E2-pIL-2可望成为猪瘟候选疫苗。

关键词：猪瘟病毒 E2基因猪白细胞介素2 重组腺病毒细胞因子佐剂

血红蛋白源抗菌肽hemocidins研究进展

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黑龙江畜牧兽医 2024年第18期 17-22页

作者：徐彦召邓丽李杰杭柏林河南科技学院动物科技学院河南新乡453003 新乡市农业农村局畜产品质量监测检验中心河南新乡453003

血红蛋白及其降解片段在人和动物体内有着多种多样的生理功能。血红蛋白降解后产生的具有抗菌活性的片段被称为hemocidins。hemocidins是一类重要的内源性抗菌肽,其来源宿主广泛、抗菌谱广。根据抗菌肽的构效关系,计算机辅助设计的hemoc... 详细信息

血红蛋白及其降解片段在人和动物体内有着多种多样的生理功能。血红蛋白降解后产生的具有抗菌活性的片段被称为hemocidins。hemocidins是一类重要的内源性抗菌肽,其来源宿主广泛、抗菌谱广。根据抗菌肽的构效关系,计算机辅助设计的hemocidins类似肽也具有较好的抗菌活性。文章主要对hemocidins及其类似肽的抗菌活性和抗菌机制进行了简要综述,以期为深入研究和开发hemocidins及其类似肽提供一些参考,进而为防治人与动物病原菌感染提供理论依据。

关键词：血红蛋白 hemocidins 类似肽抗菌活性作用机制

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育肥期香猪的饲养管理

农村新技术 2018年第1期 30-31页

作者：徐彦召王青

育肥的仔香猪以自繁自养为宜。不到疫区选购猪源，购入的育肥仔香猪要隔离2周以上，观察其健康、无病，并进行猪瘟、猪肺疫、猪丹毒、仔猪副伤寒的免疫注射。

关键词：育肥期香猪饲养管理仔猪副伤寒自繁自养免疫注射猪肺疫猪丹毒

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嵌杯病毒主要衣壳蛋白的研究进展

畜牧兽医学报 2024年第8期55卷 3354-3361页

作者：谈晓梅徐彦召刘光清孟春春中国农业科学院上海兽医研究所伴侣动物生物安全与防控技术团队上海200241 河南科技学院新乡453003

嵌杯病毒(calicivirus)是无囊膜的单股正链RNA病毒,具有广泛的宿主范围因而严重威胁着人和许多其他脊椎动物的健康。由于该病毒种属流行株多变、极易传播且呈现区域性感染,致使全球范围内因杯状病毒引起的公共卫生疾病频繁暴发,近年来,... 详细信息

嵌杯病毒(calicivirus)是无囊膜的单股正链RNA病毒,具有广泛的宿主范围因而严重威胁着人和许多其他脊椎动物的健康。由于该病毒种属流行株多变、极易传播且呈现区域性感染,致使全球范围内因杯状病毒引起的公共卫生疾病频繁暴发,近年来,其感染发病率呈明显增加的趋势。不同属成员虽然感染不同种类的宿主,但其主要衣壳蛋白的结构类似。嵌杯病毒主要衣壳蛋白中含有免疫原性关键区域,能与宿主受体结合并可能介导感染过程,且氨基酸相关的免疫原性及受体结合位点的变异是公认的病毒进化的驱动力。本文就嵌杯病毒主要衣壳蛋白的基因组结构、免疫原性、受体结合情况以及遗传演化规律等方面的研究进展进行综述,以期为后续科学研究以及该病的有效防控提供参考。

关键词：嵌杯病毒主要衣壳蛋白结构功能

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