猪瘟病毒E2糖蛋白分泌型表达载体的构建及其免疫效果研究

作     者：徐彦召 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张彦明

授予年度：2009年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪瘟病毒 E2基因 分泌表达 抗体检测 

摘      要：猪瘟（Classical swine fever ,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）,引起的猪的一种高度接触性传染病,本病给世界的养猪业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫在猪瘟的防控中起到了关键作用,特别是中国研制成功的猪瘟兔化弱毒疫苗,给中国乃至世界范围内猪瘟的防控起到了积极作用。该疫苗也存在不足之处,如不能区分机体产生的抗体是由疫苗免疫引起的还是感染野毒引起的,故而影响了国际间的猪和猪肉的贸易。因此,开发具有鉴别意义的猪瘟基因工程疫苗势在必行。本研究构建了表达CSFV石门株E2基因的分泌型真核表达载体和重组腺病毒表达载体pAd-lgk-E2sh,并将其在永生化的猪血管内皮细胞中分泌表达,对收集到的目的蛋白进行初步定量并进行小鼠免疫试验,为研制猪瘟基因工程亚单位疫苗奠定基础。 1.表达CSFV E2基因和E2去除跨膜区基因真核分泌型的的构建及鉴定。首先用PCR方法分别从pMD-19T-E2质粒中扩增出E2基因全长序列（E2qc）和E2基因去除跨膜区的基因序列（E2sh）,分别将其克隆入真核分泌型表达载体pSec-Tag 2（A）中,成功构建pSec-Tag-E2qc和pSec-Tag-E2sh。分别通过脂质体转染的方法将构建好的阳性载体使其在永生化的猪脐静脉血管内皮细胞中表达,经SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白的表达量和活性,结果显示,去除E2基因跨膜区序列的真核表达载体转染细胞成功地将目的蛋白分泌到培养基中,并能与猪瘟阳性血清相结合。 2.表达CSFV E2基因的重组腺病毒pAd-lgk-E2的构建及鉴定。首先用PCR方法从pSec-Tag-E2sh质粒中扩增出lgk-E2基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建出重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack- lgk-E2。用PmeⅠ内切酶对pAdTrack-lgk-E2质粒酶切线性化,回收酶切产物以后转化含有腺病毒骨架载体pAdEasier-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中使穿梭载体和骨架载体发生同源重组,得到含有lgk-E2基因的pAdTrack-lgk-E2。之后用Pac I内切酶线性化pAdTrack-lgk-E2,回收后通过脂质体介导法将骨架载体转染HEK293细胞,获得了含有目的基因的重组腺病毒pAd-lgk-E2。用同样的方法制备对照空载体腺病毒pAd-CMV。该重组病毒能在293细胞上产生典型的细胞病变和表达绿色荧光蛋白。RT-PCR检测结果表明lgk-E2基因被成功转录,感染永生化的猪脐静脉血管内皮细胞后,SDS-PAGE和Western blot显示目的基因成功表达,并具有很好的反应原性。 3.表达的CSFV E2蛋白的小鼠免疫试验。将收集到的含有目的蛋白的细胞上清液用超低温冷冻干燥处理的方法初步估算出E2蛋白的表达量约为100μg/ mL。将24只Balb/c小鼠随机分为6组,每组4只,经腹腔和肌肉注射3个不同抗原含量的免疫原,同时设阳性,阴性和空白对照,经2次免疫后用猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒检测抗体。结果表明,通过2次免疫后小鼠产生了针对CSFV的特异性抗体,抗体滴度最高可达1∶1 500。