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BMAL1调控STX17诱导海马神经细胞自噬体与溶酶体融合在Aβ异常沉积中的机制研究

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BMAL1调控STX17诱导海马神经细胞自噬体与溶酶体融合在Aβ异常沉...

作者：周秀雅山西医科大学

学位级别：硕士

随着人口老龄化进程的加速,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的患病率逐年升高。截至2021年底,我国每100名老年人中便有3.75人患有阿尔茨海默病。并且该病的致死率也在不断攀升,位列2019年中国主要疾病死因排行榜第5位。然而目前... 详细信息

随着人口老龄化进程的加速,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的患病率逐年升高。截至2021年底,我国每100名老年人中便有3.75人患有阿尔茨海默病。并且该病的致死率也在不断攀升,位列2019年中国主要疾病死因排行榜第5位。然而目前尚无有效的治疗方法,因此对其发病机制的深入研究显得尤为重要。AD的主要病理改变是大脑皮质和海马内出现了β淀粉样蛋白(Amyloidβpeptide,Aβ)和Tau变性蛋白聚集体。目前认为Aβ聚集在AD疾病进程中发挥着关键作用,Aβ可以诱导神经元发生进行性不可逆性损伤,从而导致认知功能障碍和记忆力减退。其中,Aβ的产生和清除失衡是导致Aβ异常累积的重要原因。研究表明,细胞外Aβ的聚集与细胞内Aβ的异常沉积密切相关,且细胞内Aβ毒性作用的出现甚至早于细胞外Aβ。细胞内Aβ是由其前体蛋白APP(Amyloid precursor protein)在细胞器膜上经过β-分泌酶和γ-分泌酶剪切或内吞细胞外Aβ形成;主要通过细胞自噬、内体/溶酶体降解和泛素-蛋白酶体系统(UPS)清除。然而在AD患者脑中,Aβ的清除速率明显降低,因此如何提高Aβ的清除速率成为拟解决的关键问题。自噬作为Aβ清除的重要途径,具有重要的神经保护功能,自噬体形成后,通过与溶酶体融合清除胞内受损和有毒性作用的蛋白质,阻止神经元丢失延缓AD的发病进程。研究发现AD患者轴突末端存在大量异常累积的自噬体,提示AD进程中自噬流受阻。本研究第一部分通过检测APP/PS1双转基因小鼠海马组织以及APP过表达的小鼠海马神经细胞HT22等AD模型自噬指标和Aβ发现,AD模型中存在Aβ异常沉积和自噬阻滞现象,且电镜观察APP/PS1双转基因小鼠海马组织发现神经元内存在大量自噬小体和少量自噬溶酶体,提示自噬阻滞可能与自噬体和溶酶体融合障碍相关,但具体机制不清。因此,本研究第二部分通过生物信息学分析,发现AD患者脑中与自噬体和溶酶体融合的显著差异因子突触融合蛋白17(Syntaxin17,STX17)。STX17每个结构域均含有甘氨酸拉链状结构,两个跨膜结构域共同形成独特的发夹结构,可实现对自噬体的定位。STX17通过与可溶性NSF粘附蛋白29(Soluble NSF attachment protein 29,SNAP29)和囊泡相关膜蛋白8(Vesicle-associated membrane protein 8,VAMP8)结合形成SNARE复合体,在细胞自噬体和溶酶体的融合过程中发挥着重要作用,其中STX17是SNARE复合体形成的始动因素和关键因子。本研究第二部分通过检测STX17发现,STX17在AD模型中表达量降低。进一步敲低STX17后自噬流阻滞,Aβ异常沉积增多;而过表达STX17后,发现SNARE复合体形成增多促进自噬流恢复使Aβ异常沉积减少,推测AD模型中神经细胞STX17的转录抑制是引起自噬体与溶酶体融合障碍的重要因素。但是,目前AD进程中导致STX17转录下调的机制目前尚不清楚。研究发现,AD患者早期即可出现睡眠-觉醒周期破坏等昼夜节律紊乱症状。昼夜节律以24小时为周期,其产生和维持由生物钟相关基因调控,即正调控元件(BMAL1、CLOCK)和负调控元件(PER、CRY)组成转录翻译水平的负反馈调节通路(Transcriptional-Translational Feedback Loop,TTFL)。其中,自噬节律受生物钟昼夜节律调控,而STX17属于钟控基因(Clock-controlled genes,CCGs),在生物钟基因下游受昼夜节律输出信号的调控。进一步在调控基因组研究中发现,STX17不受CLOCK的调控,而受BMAL1调控。BMAL1蛋白作为正调节因子,可以进入细胞核调控下游因子的转录,提示BMAL1蛋白对STX17转录调控的可能性。本研究第三部分通过Motif预测BMAL1与STX17的结合位点,通过双荧光素酶报告技术观察BMAL1与STX17的结合情况,发现BMAL1可以结合在STX17启动子上,调控STX17的转录。综上所述,本研究提出STX17是调控自噬体与溶酶体融合的关键因子,BMAL1蛋白可以促进STX17转录诱导STX17-SNAP29-VAMP8复合体形成,从而通过自噬清除Aβ,延缓AD发病进程。本研究拟从自噬和生物节律的角度对阿尔茨海默病的机制进行分析,旨在为开发AD治疗药物提供新策略。第一部分AD过程中海马神经细胞可出现自噬体和溶酶体融合障碍及Aβ异常沉积研究目的:探究AD过程中海马神经细胞自噬体与溶酶体融合障碍及细胞内Aβ累积情况。研究方法:(1)实验动物分组和收集海马组织:选取同月龄(4月龄,8月龄)的雄性WT小鼠和APP/PS1双转基因小鼠取海马组织。(2)AD细胞

关键词：阿尔茨海默病海马自噬体溶酶体融合 Aβ STX17 SNAP29 昼夜节律 BMAL1

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乔治·奥威尔《动物农庄》在中国的研究简述

语言与文化研究 2011年第2期9卷 244-247页

作者：周秀雅许卉艳中国矿业大学外语系

《动物农庄》是英国作家乔治·奥威尔最重要的作品之一,小说影响最为深远之处在于作者政治上独到的见解和深远的预见性。近年来,中国学者对该作品的研究已取得了显著的成就,但主要集中在探讨作品的创作背景、写作风格及其在世界范围内... 详细信息

《动物农庄》是英国作家乔治·奥威尔最重要的作品之一,小说影响最为深远之处在于作者政治上独到的见解和深远的预见性。近年来,中国学者对该作品的研究已取得了显著的成就,但主要集中在探讨作品的创作背景、写作风格及其在世界范围内的巨大影响力上,对其中政治观点的研究还不够深入系统。

关键词：乔治·奥威尔《动物农庄》政治思想文学艺术特征研究综述

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乔治·奥威尔《动物农庄》在中国的研究简述

乔治·奥威尔《动物农庄》在中国的研究简述

突触融合蛋白17通过调节自噬减少阿尔茨海默病细胞模型中淀粉样物质沉积

作者：周秀雅许卉艳中国矿业大学外语系

关键词：乔治·奥威尔《动物农庄》政治思想文学艺术特征研究综述

来源： cnki会议评论

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中国病理生理杂志 2023年第3期39卷 385-392页

作者：周秀雅马明霞王宁刘婷李杨王丽王晓晖山西医科大学基础医学院病理教研室山西太原030001 山西医科大学基础医学研究中心山西太原030001

目的:探究突触融合蛋白17(STX17)对小鼠海马神经元HT22细胞中自噬和淀粉样物质沉积的影响及可能机制。方法:用慢病毒介导HT22细胞内淀粉样前体蛋白(APP)和STX17过表达,RT-qPCR检测慢病毒感染后各组细胞中APP和微管相关蛋白1轻链3-II(LC3... 详细信息

目的:探究突触融合蛋白17(STX17)对小鼠海马神经元HT22细胞中自噬和淀粉样物质沉积的影响及可能机制。方法:用慢病毒介导HT22细胞内淀粉样前体蛋白(APP)和STX17过表达,RT-qPCR检测慢病毒感染后各组细胞中APP和微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)及STX17的mRNA表达情况。刚果红染色观察HT22细胞中淀粉样物质沉积情况。Western blot检测自噬相关蛋白LC3-II和P62的表达。免疫荧光观察细胞中STX17定位,以及LC3-II定位和斑点数量。结果:HT22细胞成功过表达APP后,淀粉样物质沉积增多,STX17表达下降,STX17主要定位在细胞质内,LC3-II和P62表达明显增多。过表达STX17后,LC3-II和P62表达下降,淀粉样物质沉积减少。结论:STX17通过调节自噬减少阿尔茨海默病淀粉样物质沉积。

关键词：突触融合蛋白17 自噬阿尔茨海默病淀粉样前体蛋白

突触融合蛋白17改善Aβ31-35诱导的小鼠海马神经细胞死亡

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陆军军医大学学报 2022年第17期44卷 1712-1719页

作者：王宁周秀雅何星鸿张立飞李朋佳师姝王丽王晓晖山西医科大学基础医学院病理教研室太原030001 山西医科大学基础医学院基础医学研究中心太原030001

目的探究突触融合蛋白17(syntaxin17,STX17)在Aβ诱导的小鼠海马神经细胞死亡中的作用。方法基于WGCNA方法选取与阿尔茨海默病显著相关的基因,与自噬基因库和SNARE家族基因取交集筛选关键基因;C57BL/6小鼠海马组织中注射浓度为1 g/L的A... 详细信息

目的探究突触融合蛋白17(syntaxin17,STX17)在Aβ诱导的小鼠海马神经细胞死亡中的作用。方法基于WGCNA方法选取与阿尔茨海默病显著相关的基因,与自噬基因库和SNARE家族基因取交集筛选关键基因;C57BL/6小鼠海马组织中注射浓度为1 g/L的Aβ31-35和使用终浓度为5μmol/L Aβ31-35处理HT22海马神经细胞,采用Western Blot检测STX17、LC3Ⅱ、P62的蛋白表达情况;CCK-8法检测Aβ31-35处理的HT22海马神经细胞存活率;慢病毒介导HT22海马神经细胞STX17过表达后,Western blot检测Aβ31-35处理后LC3Ⅱ、P62的蛋白表达情况。结果与阿尔茨海默病显著相关的Salmon和Black模块分别与自噬基因库和SNARE亚家族取交集获取关键基因STX17。与对照组比较,经Aβ31-35处理后,HT22细胞细胞存活率[(81.81±11.65)%]明显下降(P<0.05),小鼠海马组织和HT22细胞中STX17蛋白表达均显著降低(P<0.05),LC3Ⅱ和P62蛋白表达均显著升高(P<0.05);慢病毒介导HT22海马神经细胞STX17过表达后,显著逆转Aβ31-35诱导的LC3Ⅱ、P62的蛋白表达上调(P<0.05),并改善Aβ31-35诱导的HT22海马神经细胞存活率下降[(101.91±13.81)%vs(79.21±8.75)%,P<0.05]。结论STX17通过促进自噬来改善Aβ诱导的小鼠海马神经细胞死亡。

关键词： STX17 Aβ 小鼠海马神经细胞细胞死亡自噬

Per2蛋白抑制β_(1)-肾上腺素受体自身抗体诱导的心肌细胞死亡

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陆军军医大学学报 2022年第9期44卷 898-905页

作者：李朋佳贾微微陆洁蓓马明霞周秀雅王宁原媛郭蕊牛晓辰王晓晖王丽山西医科大学基础医学院基础医学研究中心太原030001 山西医科大学基础医学院形态学实验室太原030001 山西医科大学附属人民医院太原030012

目的探讨周期蛋白2(period 2,Per2)在β_(1)-肾上腺素受体(β_(1)-adrenergic receptor,β_(1)-AR)自身抗体(β_(1)-adrenergic receptor autoantibodies,β_(1)-AA)诱导的心肌细胞死亡中的作用。方法选取6~8周龄SD雄性大鼠16只随机分为主动免疫组[模型组,采用β_(1)-肾上腺素受体细胞外第二环抗原肽段(β_(1)-AR-ECⅡ)对大鼠进行主动免疫]和对照组(同期注射Na_(2)CO_(3)等溶液),每组8只。8周时取大鼠血清,提纯β_(1)-AA。购买H9c2心肌细胞,随机分为Control组、β_(1)-AA组和β_(1)-AR+β_(1)-AA组,CCK-8法检测细胞存活率(n=8);Control组和β_(1)-AA(1μmol/L)组细胞经地塞米松同步化4 h后,Western blot检测两组不同时间点心肌细胞Per2的表达,JTK_CYCLE分析昼夜节律参数(n=11);分别采用慢病毒shPer2和Per2敲低或过表达心肌细胞中Per2的表达,RT-PCR和Western blot检测Per2的表达(n=6);在慢病毒敲低Per2(n=8)和过表达Per2(n=10)基础上,结合β_(1)-AA处理,CCK-8法检测心肌细胞存活率。结果CCK-8结果显示,β_(1)-AA诱导H9c2细胞存活率明显降低(P0.05),其中CT8和CT16降低最为明显(P<0.01)。慢病毒敲低Per2表达可引起心肌细胞存活率降低;在此基础上进行β_(1)-AA处理,细胞存活率进一步降低(P<0.001)。而过表达Per2可明显逆转β_(1)-AA诱导的心肌细胞存活率下降(P<0.001)。结论Per2抑制β_(1)-AA诱导的H9c2心肌细胞死亡。

关键词：心肌细胞 β_(1)-肾上腺素受体自身抗体 Per2 昼夜节律细胞死亡

慢病毒干扰TNF-α对脊髓损伤大鼠Caspase-3和Bcl-2表达的影响

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实用医学杂志 2016年第17期32卷 2807-2812页

作者：王一枝胡析周秀雅向虹雨林娅唐冰怡唐婷婷曾茜张晓成都医学院基础医学实验教学中心 610500 成都医学院 610500

目的:采用慢病毒抑制炎症因子TNF-α的表达,观察凋亡相关因子Caspase-3和Bcl-2、Bax在脊髓损伤大鼠损伤段的表达变化,探究在脊髓损伤中TNF-α与Caspase-3、Bcl-2、Bax的相互关系。方法:采用Allen法制备脊髓钝挫伤模型;Gene MANIA生物信... 详细信息

目的:采用慢病毒抑制炎症因子TNF-α的表达,观察凋亡相关因子Caspase-3和Bcl-2、Bax在脊髓损伤大鼠损伤段的表达变化,探究在脊髓损伤中TNF-α与Caspase-3、Bcl-2、Bax的相互关系。方法:采用Allen法制备脊髓钝挫伤模型;Gene MANIA生物信息学方法预测TNF-α与Bcl-2的关系。用慢病毒包装的RNA,构建TNF-α的RNA干扰模型;TNF-α的表达被抑制后,用QRT-PCR检测Caspase-3和Bcl-2 m RNA的表达,用免疫组织化学技术检测Caspase-3和Bcl-2、Bax蛋白质的定位分布,用SPSS 17.0进行统计分析。结果:脊髓钝挫伤后SD大鼠双后肢截瘫,无法自行排便排尿。慢病毒干扰TNF-α后QRT-PCR结果显示,Caspase-3表达显著减少(P0.05)。免疫组织化学实验结果显示在脊髓白质和灰质的神经元和神经胶质细胞中观察到Caspase-3、Bcl-2、Bax的免疫阳性反应细胞,并与QRT-PCR变化结果相同。结论:在脊髓损伤后的大鼠体内TNF-α能有效调控Bcl-2和Bax的比值,进而调节Caspase-3的表达,最终可能影响凋亡而作用于脊髓损伤后的功能恢复。

关键词：脊髓损伤 TNF—α Bcl-2 Bax Caspase-3

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自然铜发挥“接骨疗伤”功效的有效成分探讨

广州中医药大学学报 2018年第4期35卷 706-710页

作者：易学良王雪胡刚黄媛李盈洁周秀雅唐雨蝶张晓郄蓓蓓成都医学院四川成都610500 成都医学院基础医学实验教学中心四川成都610500

【目的】观察自然铜与硫氢化钠(NaHS)对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,初步探讨自然铜发挥"接骨疗伤"功效的可能有效成分。【方法】培养大鼠骨髓间充质干细胞并诱导其转化为成骨细胞,以自然铜与NaHS分别进行干预,采用钙钴法观... 详细信息

【目的】观察自然铜与硫氢化钠(NaHS)对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,初步探讨自然铜发挥"接骨疗伤"功效的可能有效成分。【方法】培养大鼠骨髓间充质干细胞并诱导其转化为成骨细胞,以自然铜与NaHS分别进行干预,采用钙钴法观察成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)表达,采用茜素红染色法观察成骨细胞钙结节表达,并对阳性表达的ALP和钙结节进行积分光密度(IOD)的测定。【结果】ALP染色结果显示:与对照组比较,NaHS组ALP表达水平于7、14 d显著增加,自然铜组ALP表达水平于3、7、14 d显著增加(P<0.05);与NaHS组比较,自然铜组3、14 d ALP表达水平显著增加(P<0.05)。茜素红染色结果显示:与对照组和NaHS组比较,自然铜组14 d时钙结节表达水平显著增加(P<0.05)。【结论】自然铜可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且二硫化亚铁可能是自然铜起"接骨疗伤"作用的有效成分。

关键词：自然铜接骨疗伤二硫化亚铁骨髓间充质干细胞成骨细胞

槲皮素抑制p53表达改善过氧化氢诱导的神经细胞死亡

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山西医科大学学报 2023年第7期54卷 952-962页

作者：徐梦如张稳稳牛晓辰马明霞周秀雅龙瑶琳李晨赵亚平王丽郝海虎山西中医药大学第一临床学院骨伤教研室晋中030619 山西医科大学第三医院山西白求恩医院山西医学科学院骨科山西医科大学基础医学研究中心山西医科大学第五临床医学院山西省人民医院神经外科山西医科大学基础医学院病理教研室

目的研究槲皮素对过氧化氢(H_(2)O_(2))引起的神经细胞损伤的潜在保护作用及机制。方法为模拟脊髓损伤后神经细胞出现的缺氧损伤,使用不同浓度的H_(2)O_(2)(0,100,200,300,400,500,600,700μmol/L)对SH-SY5Y细胞进行干预8 h,采用CCK-... 详细信息

目的研究槲皮素对过氧化氢(H_(2)O_(2))引起的神经细胞损伤的潜在保护作用及机制。方法为模拟脊髓损伤后神经细胞出现的缺氧损伤,使用不同浓度的H_(2)O_(2)(0,100,200,300,400,500,600,700μmol/L)对SH-SY5Y细胞进行干预8 h,采用CCK-8试剂检测细胞存活率,并结合显微镜下观察,摸索H_(2)O_(2)造模的最佳浓度。使用不同浓度(10,25,50,100,200μmol/L)的槲皮素(quercetin,QUE)对SH-SY5Y细胞进行预处理4 h,再予以H_(2)O_(2)造模处理,通过CCK-8法检测细胞存活率。使用生物信息技术预测槲皮素改善脊髓损伤后神经细胞缺氧损伤的可能作用靶点,首先在TCMSP数据库中筛选槲皮素的作用靶点,同时在5个疾病相关数据库检索与脊髓损伤相关靶点基因,筛选获得槲皮素和脊髓损伤的共同靶点,对靶点蛋白进行PPI蛋白互作分析,并利用Cytoscape中的cytoNCA进行关键靶点的筛选。为进一步验证预测的靶点是否参与槲皮素对神经细胞缺氧损伤的改善作用,将SH-SY5Y细胞分为control组、H_(2)O_(2)组(400μmol/L H_(2)O_(2)作用8 h)以及QUE组(100μmol/L QUE预处理4 h后再予以H_(2)O_(2)干预),使用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同分组p53蛋白的表达水平。为验证p53蛋白在槲皮素干预H_(2)O_(2)诱导的神经细胞损伤中的作用,使用慢病毒感染SH-SY5Y细胞以构建p53蛋白敲低的细胞稳转株以及病毒空白载体对照(shRNA-NC),将携带慢病毒的SH-SY5Y细胞分为shRNA-NC组、shRNA+H_(2)O_(2)组和shTP53+H_(2)O_(2)组,shRNA+H_(2)O_(2)组在感染病毒空载的基础上予以H_(2)O_(2)干预,shTP53+H_(2)O_(2)组在成功感染p53敲低慢病毒的基础上再给予H_(2)O_(2)处理8 h,利用CCK-8检测不同分组细胞的存活率变化。结果 300,400,500,600,700μmol/L H_(2)O_(2)对SH-SY5Y细胞造成不同程度的损伤,细胞存活率随着H_(2)O_(2)浓度的升高而降低(P<0.05),浓度为400μmol/L的H_(2)O_(2)持续作用8 h能够造成SH-SY5Y细胞近半数死亡(P<0.001),此时镜下观察显示:部分细胞形态严重损伤并有少量细胞碎片。使用50,100,200μmol/L槲皮素对细胞进行预处理可减少H_(2)O_(2)诱导的神经细胞死亡,提高细胞存活率(P<0.05)。通过生物信息技术分析获取槲皮素治疗脊髓损伤的作用靶点有91个,使用Cytoscape软件中的cytoNCA筛选槲皮素作用的关键靶点为p53。Western blot检测结果显示:与control组相比,H_(2)O_(2)组p53蛋白表达显著升高(P<0.05),而与H_(2)O_(2)组相比,QUE组p53蛋白表达则明显下降(P<0.001)。CCK-8结果显示,与shRNA-NC组相比,shRNA+H_(2)O_(2)组细胞存活率明显降低(P<0.001);而与shRNA+H_(2)O_(2)组相比,shTP53+H_(2)O_(2)组的细胞存活率则明显升高(P<0.001)。结论槲皮素通过抑制p53蛋白的表达减少H_(2)O_(2)诱导的神经细胞死亡。

关键词：槲皮素脊髓损伤神经细胞 p53 生信分析