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热疗通过调控巨噬细胞极化对口腔鳞癌细胞生物学行为影响的研究

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热疗通过调控巨噬细胞极化对口腔鳞癌细胞生物学行为影响的研究

作者：周学筱青岛大学

学位级别：硕士

研究背景与目的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAM)是肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)中数量最多的免疫细胞,其表型主要为M2型,发挥促肿瘤作用。口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)中有大量TAM浸润且和OSCC生长、转移及预后关系密切。TAM的表型受TME的影响,提示通过调节TAM的极化表型可能改变机体抗肿瘤免疫应答能力,逆转其免疫抑制作用是全面调动自身免疫系统来对抗、减缓甚至是治愈肿瘤的关键。热疗(Hyperthemia,HT)因为无创、副作用小及可以启动全身免疫等优点被称为绿色疗法,随着对加热技术、测温技术及热生物学的研究越来越多,使肿瘤HT进入一个飞速发展的时期。HT对机体抗肿瘤免疫反应的影响受到了极大的关注,但HT在TME中对TAM极化的影响却鲜有报道。鉴于TAM的极化表型对OSCC发生发展的重要性,有必要深入了解HT对OSCC免疫微环境中TAM的影响。因此,本研究通过体外构建巨噬细胞模型,采用分子生物学实验方法检测热疗对巨噬细胞极化表型的影响,进一步研究热疗后巨噬细胞对OSCC细胞恶性生物学行为的影响作用。本课题从免疫学的角度研究HT的抗肿瘤机制,为OSCC的临床治疗提供新的治疗思路。实验方法1、将人外周血单核细胞系THP-1诱导为M0巨噬细胞后,分别加入LPS、INF-γ和IL-4诱导其分化为M1型和M2型巨噬细胞。用人舌鳞癌细胞株CAL-27与M0巨噬细胞构建Transwell小室共培养体系诱导OSCC-TAM模型。倒置显微镜下观察不同表型巨噬细胞的形态,并通过q RT-PCR检测巨噬细胞极化标志物TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的表达情况;流式细胞术检测巨噬细胞表面标志抗原CD86和CD206的表达变化;细胞免疫荧光法检测INOS和Arg-1的表达。2、以37℃恒温培养为对照组,用q RT-PCR、流式细胞术和细胞免疫荧光实验分别检测了M1、M2和TAM这三种类型巨噬细胞在39.5℃和42℃热处理1h后的M1型和M2型巨噬细胞极化标志物表达水平变化。3、以正常培养的CAL-27细胞为对照组,将M1型、M2型和TAM三种亚型巨噬细胞分别与CAL-27细胞构建间接共培养体系。用CCK-8法、细胞克隆实验、划痕实验和Transwell侵袭实验检测不同巨噬细胞表型对CAL-27细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。4、体外构建不同表型巨噬细胞和CAL-27细胞的间接共培养体系,以37℃恒温培养为对照组,通过CCK-8法、细胞克隆实验、划痕实验和Transwell侵袭实验检测39.5℃和42℃热疗后各组巨噬细胞对CAL-27细胞的增殖和迁移侵袭能力的影响。实验结果1、体外构建M1型、M2型和OSCC-TAM巨噬细胞模型,通过q RT-PCR、流式细胞术和细胞免疫荧光实验分别检测巨噬细胞极化标志物的表达水平,结果表明M0巨噬细胞在LPS+IFN-γ作用下成功诱导为M1型,在IL-4刺激下诱导为M2型,M0巨噬细胞与CAL-27细胞共培养后成功诱导为OSCC-TAM,且其中M2型极化标志物表达量相对较多。2、通过上述实验方法检测M1、M2和TAM这三种类型巨噬细胞在不同温度(37℃、39.5℃、42℃)作用下的巨噬细胞极化标志物的表达水平变化。实验结果显示与37℃组和39.5℃组相比,42℃组中M1型巨噬细胞极化标志物TNF-α、IL-1β、CD86和INOS的表达均升高(P<0.05),M2型巨噬细胞极化标志物TGF-β、IL-10、CD206和Arg-1的表达均下降(P<0.05),且上述现象在M1型、M2型和TAM这三种类型巨噬细胞中表现一致。3、以正常培养的CAL-27细胞为对照组,CCK-8法、细胞克隆实验、划痕实验和Transwell侵袭实验结果表明:M1+CAL-27组中CAL-27细胞增殖和迁移侵袭能力降低,M2+CAL-27组和TAM+CAL-27组中CAL-27细胞增殖和迁移侵袭能力均增强,且M2+CAL-27组较TAM+CAL-27组中CAL-27细胞的增殖和迁移侵袭能力更强(P<0.05)。4、以37℃恒温培养的共培养体系为对照组,结果表明42℃热疗后M1+CAL-27组、M2+CAL-27组和TAM+CAL-27组三组共培养体系中CAL-27细胞的增殖、迁移及侵袭数目较37℃对照组均减少(P<0.05)。结论1.巨噬细胞与口腔鳞癌细胞系CAL-27细胞共培养后成功构建OSCC-TAM,且TAM主要表现为M2型。2.42℃热疗可能通过促进M1型巨噬细胞极化标志物和抑制M2型巨噬细胞极化标志物的表达调控巨噬细胞表型,促使巨噬细胞由M2型向M1型转化。3.M1型巨噬细胞抑

关键词：口腔鳞状细胞癌热疗巨噬细胞极化肿瘤相关巨噬细胞

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肿瘤热疗生物学机制研究进展

中华放射肿瘤学杂志 2021年第12期30卷 1340-1344页

作者：沈佩周学筱石凡王升志青岛大学口腔医学院 266003 青岛大学附属烟台毓璜顶医院口腔科 264000

近年来肿瘤热疗主要作为肿瘤传统治疗的辅助疗法成为研究热点。热疗可直接诱导肿瘤细胞坏死或凋亡,或通过破坏肿瘤血管抑制其进展,同时热疗还能激活机体免疫系统的免疫细胞和细胞因子的反应,从而调节肿瘤微环境的免疫状态。多种效应相... 详细信息

近年来肿瘤热疗主要作为肿瘤传统治疗的辅助疗法成为研究热点。热疗可直接诱导肿瘤细胞坏死或凋亡,或通过破坏肿瘤血管抑制其进展,同时热疗还能激活机体免疫系统的免疫细胞和细胞因子的反应,从而调节肿瘤微环境的免疫状态。多种效应相联合共同影响肿瘤的进展。深入了解肿瘤热疗的生物学机制有利于开展新的治疗方法,本文主要对热疗杀灭肿瘤的生物学机制做一综述。

关键词：肿瘤/热疗免疫机制细胞凋亡肿瘤微环境

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热疗对肿瘤微环境中VEGF作用的研究进展

中华放射肿瘤学杂志 2023年第8期32卷 736-741页

作者：丛瑗邵云周学筱沈佩王升志青岛大学口腔医学院青岛266003 青岛大学附属烟台毓璜顶医院口腔颌面外科烟台264000

血管内皮生长因子(VEGF)在促进肿瘤血管成长、改变血管壁通透性中发挥了重要作用。随着对肿瘤热疗及肿瘤微环境的深入研究, 越来越多的研究表明热疗对肿瘤微环境中的VEGF存在多重调控作用。本文结合目前国内外研究进展, 就热疗对肿瘤微... 详细信息

血管内皮生长因子(VEGF)在促进肿瘤血管成长、改变血管壁通透性中发挥了重要作用。随着对肿瘤热疗及肿瘤微环境的深入研究, 越来越多的研究表明热疗对肿瘤微环境中的VEGF存在多重调控作用。本文结合目前国内外研究进展, 就热疗对肿瘤微环境中VEGF及其相关细胞和因子作用做一综述, 为肿瘤热疗结合免疫或靶向治疗的临床应用提供新的思路。

关键词：血管内皮生长因子肿瘤/热疗肿瘤微环境肿瘤免疫微环境

热疗与肿瘤细胞乏氧微环境下能量代谢的研究现状

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中华放射肿瘤学杂志 2021年第1期30卷 102-106页

作者：石凡孙巧珍周学筱徐婷王升志青岛大学口腔医学院 266003 青岛大学附属烟台毓璜顶医院口腔颌面外科烟台266400

代谢重编程是一种恶性肿瘤标志,指癌细胞改变代谢和营养获取模式,以满足快速增殖、侵袭与转移所需的能量及获得维持细胞分裂所需的"构建块"。当实体肿瘤暴露在低pH、乏氧和营养缺乏的微环境中,使乏氧诱导因子-1被激活,其介导肿瘤细胞重... 详细信息

代谢重编程是一种恶性肿瘤标志,指癌细胞改变代谢和营养获取模式,以满足快速增殖、侵袭与转移所需的能量及获得维持细胞分裂所需的"构建块"。当实体肿瘤暴露在低pH、乏氧和营养缺乏的微环境中,使乏氧诱导因子-1被激活,其介导肿瘤细胞重塑代谢模式,即通过循环细胞内成分如清除蛋白质和脂质等底物或利用适应性的代谢重编程如糖酵解、自噬和脂代谢等获取能量。热疗作为一种基于肿瘤局部加热的治疗方法,具有多种抗癌机制与放化疗及生物免疫治疗协同使用。在这篇综述中,我们对乏氧微环境下由乏氧诱导因子-1介导的能量代谢途径做以简单论述,同时阐述了热疗对乏氧诱导因子-1的调控机制并展望了热疗在实体肿瘤中的应用。

关键词：代谢重编程乏氧诱导因子-1 肿瘤热疗法

热疗对肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞作用的研究进展

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中华放射肿瘤学杂志 2023年第10期32卷 945-950页

作者：邵云郝玉丽丛瑗沈佩周学筱王昇志青岛大学口腔医学院青岛266003 青岛大学附属烟台毓璜顶医院口腔科烟台264000

肿瘤微环境具有免疫抑制特性,其作用机制是诱导肿瘤细胞的免疫逃逸,它与肿瘤细胞之间的相互作用是影响肿瘤发生发展的重要因素。肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境的一个重要组成部分,其主要功能是与肿瘤细胞发生直接或间接的相互作用,并... 详细信息

肿瘤微环境具有免疫抑制特性,其作用机制是诱导肿瘤细胞的免疫逃逸,它与肿瘤细胞之间的相互作用是影响肿瘤发生发展的重要因素。肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境的一个重要组成部分,其主要功能是与肿瘤细胞发生直接或间接的相互作用,并产生各种细胞因子,从而对肿瘤免疫微环境起到调节作用。肿瘤热疗作为抗肿瘤治疗的一种手段,随着对肿瘤热疗和肿瘤微环境的研究不断深入,大量研究发现热疗对肿瘤微环境中的肿瘤相关成纤维细胞具有多种调节功能。本文结合国内外最新研究进展,阐述热疗对肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞及其相关细胞和因子的影响,为肿瘤热疗结合免疫或靶向治疗的临床应用提供新途径。

关键词：肿瘤/热疗肿瘤微环境肿瘤相关成纤维细胞肿瘤免疫微环境

热疗对肿瘤免疫微环境中免疫细胞及免疫相关细胞因子的影响

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中华放射肿瘤学杂志 2020年第12期29卷 1130-1134页

作者：周学筱沈佩王升志石凡孙巧珍徐婷青岛大学口腔医学院 266003 青岛大学附属烟台毓璜顶医院口腔科 264000

随着对肿瘤热疗和肿瘤免疫微环境(TIME)的深入研究,近年来热疗对TIME的作用越来越受到学者们的重视。本文就目前国内外研究进展,对热疗与TIME中几类主要免疫细胞和免疫相关细胞因子的影响及作用机制作一综述。全面而透彻的了解热疗对TIM... 详细信息

随着对肿瘤热疗和肿瘤免疫微环境(TIME)的深入研究,近年来热疗对TIME的作用越来越受到学者们的重视。本文就目前国内外研究进展,对热疗与TIME中几类主要免疫细胞和免疫相关细胞因子的影响及作用机制作一综述。全面而透彻的了解热疗对TIME的调控作用,有助于为肿瘤治疗提供新的思路和方法。

关键词：肿瘤/热疗法肿瘤免疫微环境免疫细胞细胞因子热休克蛋白

热疗联合化疗下调HIF-1α、CYPJ的表达诱导舌鳞癌细胞凋亡

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中华放射肿瘤学杂志 2021年第3期30卷 283-288页

作者：石凡孙巧珍周学筱徐婷宋轶鹏王升志青岛大学口腔医学院 266003 青岛大学附属烟台毓璜顶医院口腔颌面外科 266400 青岛大学附属烟台毓璜顶医院放疗科 266400

目的探讨HIF-1α、CYPJ在舌鳞癌细胞(TSCC)中的作用及意义,并进一步研究热疗对HIF-1α、CYPJ的调控作用。方法收集TSCC患者癌组织及癌旁正常组织标本80例,采用免疫组化、蛋白印迹、荧光定量PCR检测各标本中HIF-1α、CYPJ的表达及其与临... 详细信息

目的探讨HIF-1α、CYPJ在舌鳞癌细胞(TSCC)中的作用及意义,并进一步研究热疗对HIF-1α、CYPJ的调控作用。方法收集TSCC患者癌组织及癌旁正常组织标本80例,采用免疫组化、蛋白印迹、荧光定量PCR检测各标本中HIF-1α、CYPJ的表达及其与临床病理特征之间的关系。采用qPCR、蛋白印迹检测Cal-27细胞在常氧及乏氧状态下以及用42℃热疗、化疗及热化疗处理时HIF-1α、CYPJ的表达情况。细胞划痕检测细胞迁移,流式细胞术检测细胞凋亡。结果HIF-1α、CYPJ蛋白在TSCC患者肿瘤组织中的表达水平高于相应的癌旁组织;且二者表达升高与TSCC患者肿瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴结转移等相关(均P0.05)。Cal-27细胞中HIF-1α、CYPJ表达水平在乏氧微环境中升高(均P<0.05),且单独热疗也促进其表达(均P<0.05)。相比于单独热疗及化疗,热化疗联合使用在明显抑制二者的表达的同时抑制细胞迁移并促进细胞凋亡(均P<0.05)。结论HIF-1α、CYPJ是TSCC肿瘤发生和预后的一个潜在生物标志物,且热疗后肿瘤复发可能源于热疗触发了HIF-1α表达,其通过激活下游靶基因促使适应热处理的肿瘤细胞生长存活,而热疗联合化疗可能是治疗TSCC一种比较有前景的治疗方案。

关键词：舌鳞状细胞癌 Cal-27细胞系乏氧诱导因子-1α 亲环素热疗

热疗联合紫杉醇对人舌鳞癌细胞系CAL-27增殖、凋亡和周期影响

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中华放射肿瘤学杂志 2022年第2期31卷 192-195页

作者：周学筱沈佩石凡邵云丛瑗徐婷王升志青岛大学口腔医学院青岛266003 青岛大学附属烟台毓璜顶医院口腔科烟台264000

目的观察热疗联合紫杉醇对人舌鳞癌细胞系CAL-27增殖、凋亡和周期的影响并探讨其机制。方法CCK-8法确定紫杉醇工作浓度,将体外培养CAL-27细胞分为对照组、紫杉醇组、42℃热疗组和联合治疗组。克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术... 详细信息

目的观察热疗联合紫杉醇对人舌鳞癌细胞系CAL-27增殖、凋亡和周期的影响并探讨其机制。方法CCK-8法确定紫杉醇工作浓度,将体外培养CAL-27细胞分为对照组、紫杉醇组、42℃热疗组和联合治疗组。克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,蛋白印迹法检测AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果紫杉醇组、热疗组及联合治疗组相比对照组均可抑制细胞增殖及促进凋亡(P<0.05),且联合治疗组优于热疗组、紫杉醇组(P<0.05)。蛋白印迹法实验结果显示联合治疗组上调Bax蛋白表达水平,同时下调P-AKT、Bcl-2表达(P<0.05)。结论42℃热疗与紫杉醇联合应用可抑制CAL-27细胞增殖及促进凋亡,其机制可能与抑制AKT活化及激活Bax/Bcl-2凋亡通路有关。

关键词：热疗紫杉醇细胞增殖细胞凋亡细胞周期人舌鳞癌细胞系

热疗调控铁死亡通路对舌鳞癌细胞生物学行为影响的研究

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中华放射肿瘤学杂志 2023年第3期32卷 260-264页

作者：沈佩郝玉丽周学筱丛瑗王升志邵云徐婷李受益青岛大学口腔医学院青岛266003 青岛大学附属烟台毓璜顶医院口腔科烟台264099 四川大学华西口腔医院口腔种植科成都610044

目的探讨热疗(HT)对舌鳞癌细胞系CAL-27铁死亡的调控作用和可能机制。方法采用CCK-8法检测铁死亡抑制剂Fer-1的半抑制浓度(IC50)并用于后续实验。CAL-27细胞系按实验设计分为HT组、对照组、Fer-1组以及HT+Fer-1组。采用各自检测试剂盒... 详细信息

目的探讨热疗(HT)对舌鳞癌细胞系CAL-27铁死亡的调控作用和可能机制。方法采用CCK-8法检测铁死亡抑制剂Fer-1的半抑制浓度(IC50)并用于后续实验。CAL-27细胞系按实验设计分为HT组、对照组、Fer-1组以及HT+Fer-1组。采用各自检测试剂盒检测活性氧水平、铁离子浓度,采用实时反转录PCR检测p53、转铁蛋白受体1(TfR1)的mRNA水平,细胞划痕法检测细胞迁移,流式细胞术检测细胞凋亡。结果热疗组CAL-27细胞系活性氧水平(P<0.01)和铁离子浓度(P<0.001)显著上调,p53及TfR1的mRNA表达量也明显增加(P值均<0.01),细胞迁移能力下降(P<0.001),凋亡率升高(P<0.01)。HT+Fer-1组与HT组相比活性氧水平(P<0.001)、铁离子浓度(P<0.001)、p53及TfR1的mRNA表达量均降低(P值均<0.01),细胞迁移能力恢复(P<0.01),凋亡率也降低(P<0.01)。结论热疗可能通过激活p53/TfR1通路诱导舌鳞癌细胞系CAL-27铁死亡,抑制其迁移能力并促进其凋亡。

关键词：热疗舌鳞状细胞癌铁死亡小分子铁抑素-1