热疗通过调控巨噬细胞极化对口腔鳞癌细胞生物学行为影响的研究

作     者：周学筱 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王升志

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：口腔鳞状细胞癌 热疗 巨噬细胞极化 肿瘤相关巨噬细胞 

摘      要：研究背景与目的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAM)是肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)中数量最多的免疫细胞,其表型主要为M2型,发挥促肿瘤作用。口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)中有大量TAM浸润且和OSCC生长、转移及预后关系密切。TAM的表型受TME的影响,提示通过调节TAM的极化表型可能改变机体抗肿瘤免疫应答能力,逆转其免疫抑制作用是全面调动自身免疫系统来对抗、减缓甚至是治愈肿瘤的关键。热疗(Hyperthemia,HT)因为无创、副作用小及可以启动全身免疫等优点被称为绿色疗法,随着对加热技术、测温技术及热生物学的研究越来越多,使肿瘤HT进入一个飞速发展的时期。HT对机体抗肿瘤免疫反应的影响受到了极大的关注,但HT在TME中对TAM极化的影响却鲜有报道。鉴于TAM的极化表型对OSCC发生发展的重要性,有必要深入了解HT对OSCC免疫微环境中TAM的影响。因此,本研究通过体外构建巨噬细胞模型,采用分子生物学实验方法检测热疗对巨噬细胞极化表型的影响,进一步研究热疗后巨噬细胞对OSCC细胞恶性生物学行为的影响作用。本课题从免疫学的角度研究HT的抗肿瘤机制,为OSCC的临床治疗提供新的治疗思路。实验方法1、将人外周血单核细胞系THP-1诱导为M0巨噬细胞后,分别加入LPS、INF-γ和IL-4诱导其分化为M1型和M2型巨噬细胞。用人舌鳞癌细胞株CAL-27与M0巨噬细胞构建Transwell小室共培养体系诱导OSCC-TAM模型。倒置显微镜下观察不同表型巨噬细胞的形态,并通过q RT-PCR检测巨噬细胞极化标志物TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的表达情况;流式细胞术检测巨噬细胞表面标志抗原CD86和CD206的表达变化;细胞免疫荧光法检测INOS和Arg-1的表达。2、以37℃恒温培养为对照组,用q RT-PCR、流式细胞术和细胞免疫荧光实验分别检测了M1、M2和TAM这三种类型巨噬细胞在39.5℃和42℃热处理1h后的M1型和M2型巨噬细胞极化标志物表达水平变化。3、以正常培养的CAL-27细胞为对照组,将M1型、M2型和TAM三种亚型巨噬细胞分别与CAL-27细胞构建间接共培养体系。用CCK-8法、细胞克隆实验、划痕实验和Transwell侵袭实验检测不同巨噬细胞表型对CAL-27细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。4、体外构建不同表型巨噬细胞和CAL-27细胞的间接共培养体系,以37℃恒温培养为对照组,通过CCK-8法、细胞克隆实验、划痕实验和Transwell侵袭实验检测39.5℃和42℃热疗后各组巨噬细胞对CAL-27细胞的增殖和迁移侵袭能力的影响。实验结果1、体外构建M1型、M2型和OSCC-TAM巨噬细胞模型,通过q RT-PCR、流式细胞术和细胞免疫荧光实验分别检测巨噬细胞极化标志物的表达水平,结果表明M0巨噬细胞在LPS+IFN-γ作用下成功诱导为M1型,在IL-4刺激下诱导为M2型,M0巨噬细胞与CAL-27细胞共培养后成功诱导为OSCC-TAM,且其中M2型极化标志物表达量相对较多。2、通过上述实验方法检测M1、M2和TAM这三种类型巨噬细胞在不同温度(37℃、39.5℃、42℃)作用下的巨噬细胞极化标志物的表达水平变化。实验结果显示与37℃组和39.5℃组相比,42℃组中M1型巨噬细胞极化标志物TNF-α、IL-1β、CD86和INOS的表达均升高(P0.05),M2型巨噬细胞极化标志物TGF-β、IL-10、CD206和Arg-1的表达均下降(P0.05),且上述现象在M1型、M2型和TAM这三种类型巨噬细胞中表现一致。3、以正常培养的CAL-27细胞为对照组,CCK-8法、细胞克隆实验、划痕实验和Transwell侵袭实验结果表明:M1+CAL-27组中CAL-27细胞增殖和迁移侵袭能力降低,M2+CAL-27组和TAM+CAL-27组中CAL-27细胞增殖和迁移侵袭能力均增强,且M2+CAL-27组较TAM+CAL-27组中CAL-27细胞的增殖和迁移侵袭能力更强(P0.05)。4、以37℃恒温培养的共培养体系为对照组,结果表明42℃热疗后M1+CAL-27组、M2+CAL-27组和TAM+CAL-27组三组共培养体系中CAL-27细胞的增殖、迁移及侵袭数目较37℃对照组均减少(P0.05)。结论1.巨噬细胞与口腔鳞癌细胞系CAL-27细胞共培养后成功构建OSCC-TAM,且TAM主要表现为M2型。2.42℃热疗可能通过促进M1型巨噬细胞极化标志物和抑制M2型巨噬细胞极化标志物的表达调控巨噬细胞表型,促使巨噬细胞由M2型向M1型转化。3.M1型巨噬细胞抑