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片状工程化肝组织体外构建及大鼠原位移植的实验研究

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片状工程化肝组织体外构建及大鼠原位移植的实验研究

作者：刘巨超中国人民解放军医学院

学位级别：硕士

背景：肝移植是终末期肝病的有效治疗手段，但供肝的严重缺乏一直制约其发展，因此解决这一难题必须寻求新的治疗技术。肝组织工程是利用肝脏细胞与载体支架复合构建可植入的类肝组织，具有缓解器官供体短缺的治疗前景。从研究角度，由... 详细信息

背景：肝移植是终末期肝病的有效治疗手段，但供肝的严重缺乏一直制约其发展，因此解决这一难题必须寻求新的治疗技术。肝组织工程是利用肝脏细胞与载体支架复合构建可植入的类肝组织，具有缓解器官供体短缺的治疗前景。从研究角度，由于肝脏血供丰富，较大尺度类肝组织在大鼠肝脏原位移植手术操作困难，至今缺乏安全有效的方法。本课题拟在体外构建较大尺度工程化肝组织并探索在大鼠体内原位移植的方法，为开辟一种新的治疗途径奠定实验基础。目的：为解决较大尺度类肝组织体内移植后难以存活的问题，本项目拟在体外构建预血管化的片状工程化肝组织，并在大鼠肝脏表面制造轻度渗血创面后将植入物贴覆其上，使构建物与肝脏尽快建立血液联通，以探索将大块工程化肝组织与原位肝脏整合的新方法。方法：1.种子细胞的制备：胰酶冷消化法获得新生大鼠肝细胞，肺组织块贴壁法分离大鼠肺微血管内皮细胞，常规培养。四唑盐(MTT)比色法评价细胞的增殖活性，免疫荧光法检测肝细胞白蛋白表达及内皮细胞CD31的表达。2.五种片状支架材料细胞相容性的体外评价：仿血管束支架材料、海绵状胶原材料、薄膜状胶原材料、聚乳酸、壳聚糖表观形貌及扫描电镜观察。新生大鼠肝细胞、内皮细胞分别与五种材料共培养。运用扫描电镜观察细胞/材料黏附情况，MTT比色法检测细胞增殖情况，白蛋白、尿素氮检测试剂盒检测肝细胞功能。3.片状工程化肝组织体外构建两步法：首先将内皮细胞/血管内皮生长因子与体积>1cm3的片状支架材料复合并共培养两小时;再将肝细胞与预血管化处理的支架材料复合1小时，构建成片状工程化肝组织。4.大鼠的肝表面贴覆移植（n=15）：先将肝脏包膜造成轻微渗血创面，再将构建的片状类肝组织以肝表面贴覆的方法植入，医用纤维蛋白胶喷洒固定，4周后取材进行大体观察及组织切片HE染色、白蛋白及CD31免疫组化染色。结果：1.分离得到的新生大鼠肝细胞约为1.5×106/鼠肝，活率95%以上，呈团簇生长。MTT值在培养7d升至峰值，随后逐渐下降。白蛋白染色阳性;分离得到的大鼠肺微血管内皮细胞贴壁率约为80%，原代细胞存活率达98%以上。贴壁后呈单层镶嵌排列铺路石状。MTT值在2-4天成倍数生长。CD31染色阳性。2.五种材料表观形貌各有不同，种子细胞与支架复合后，电镜下观察细胞分布以海绵状胶原材料最适合细胞黏附。细胞的增殖情况经MTT检测显示：肝细胞的增殖依次为海绵状胶原材料>仿血管束支架材料>薄膜状胶原材料>壳聚糖>聚乳酸;内皮细胞的增殖依次为海绵状胶原材料>仿血管束支架材料>薄膜状胶原材料>壳聚糖>聚乳酸。肝细胞培养上清中白蛋白和尿素的含量测定表明海绵状胶原材料结果最佳;经上述实验筛选后，选择海绵状胶原材料作为后续构建工程化肝组织的载体支架。3.体外构建的片状工程化肝组织大小约（1.5×1.5×0.6）cm3，镜下观察可见：海绵状胶原材料上，预培养2小时的血管内皮细胞已围绕胶原细丝贴壁聚集成团，达到了预血管化的目的。大量肝细胞被胶原细丝包绕密集成团，几乎布满所有孔隙。4.片状工程化肝组织通过肝表面贴覆法能够简便安全地植入大鼠肝脏原位，并且与受体肝脏完全整合，形成体积>1cm3的新生组织，H.E.染色显示新生组织内肝细胞形态良好，相互连接成片，内皮细胞可在组织内部形成大小不等的管腔,内有红细胞分布。免疫组化染色显示新生组织表达白蛋白，内部形成的管腔表达CD31。结论：1.新生大鼠肝细胞及肺微血管内皮细胞分别可以通过胰酶冷消化法及组织块贴壁法简便、高效的获得，在体外培养条件下具有增殖活性且保持原有的分泌功能，可以作为构建工程化肝组织的种子细胞应用于肝组织工程研究。2.海绵状胶原材料与肝脏细胞相容性良好，适合作为构建片状工程化肝组织的载体支架。3.种子细胞分别于不同时间与支架材料复合的类肝组织构建法能够成功在体外构建出预血管化的片状工程化肝组织。4.肝表面原位贴覆法可以简便安全地将较大尺度的工程化肝组织移植到大鼠肝脏原位，并能在肝表面形成体积>1cm3且具有一定功能的类肝组织，这种方法具有潜在的应用前景，为后续原位修复受损肝脏提供可行方案。

关键词：肝组织工程新生大鼠肝细胞血管内皮细胞生物支架材料原位移植

肝大部切除术后小鼠血浆蛋白质组双向凝胶电泳图谱差异分析

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中华实验外科杂志 2006年第4期23卷 557-559页

作者：宁宁刘巨超夏季刘斯奇徐迎新解放军总医院普通外科研究所北京100853 中国科学院北京基因组研究所北京华大蛋白研发中心

目的利用蛋白质组学的研究方法建立分辨率高和重复性好的肝大部切除术后小鼠血浆的双向凝胶电泳图谱,描述肝大部切除后早期血浆蛋白质组变化的概况。方法以肝大部切除术方法制备小鼠模型,对12 h后切肝组及对照组小鼠血浆样品分别进行双... 详细信息

目的利用蛋白质组学的研究方法建立分辨率高和重复性好的肝大部切除术后小鼠血浆的双向凝胶电泳图谱,描述肝大部切除后早期血浆蛋白质组变化的概况。方法以肝大部切除术方法制备小鼠模型,对12 h后切肝组及对照组小鼠血浆样品分别进行双向凝胶电泳,每组设平行胶3块,凝胶经银染显色后,Imaging Master 2D图像分析软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质。结果与对照组比较,切肝后12 h小鼠血浆蛋白中新增蛋白点37个,缺失15个,浓度上调蛋白点4个,下调7个,总的差异表达蛋白点数为63个。结论本研究建立了分辨率高且重复性较好的肝再生小鼠的血浆蛋白质组学双向凝胶电泳图谱,发现了一批与对照组相比差异表达的蛋白质,为进一步分析鉴定与肝脏再生启动相关的关键蛋白,探寻肝脏再生的机制奠定了基础。

关键词：肝切除术血浆蛋白质组学双向凝胶电泳

脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞基因表达谱分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第10期24卷 773-777页

作者：李崇辉陈明易刘巨超臧传波徐迎新黄志强解放军总医院肝胆外科研究所北京00853 解放军总医院普通外科研究所北京00853

目的　利用基因芯片技术分析脂多糖 (LPS)活化的小鼠腹腔巨噬细胞基因表达谱 ,以更全面地了解LPS诱导的巨噬细胞反应。方法　以未刺激的和用 1mg/LLPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞制备3 3 P标记的cDNA探针 ,分别与含有 1176个已知基因的小鼠c... 详细信息

目的　利用基因芯片技术分析脂多糖 (LPS)活化的小鼠腹腔巨噬细胞基因表达谱 ,以更全面地了解LPS诱导的巨噬细胞反应。方法　以未刺激的和用 1mg/LLPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞制备3 3 P标记的cDNA探针 ,分别与含有 1176个已知基因的小鼠cDNA芯片杂交。结果　活化组和未刺激组间的 2倍差异表达基因为 118个 ,3倍差异表达基因为 6 9个 ,其中 4 4个上调 ,2 5个下调。转录因子、细胞内信号调节蛋白、炎症细胞因子和细胞凋亡相关基因的转录发生明显的调节变化。结论提供了LPS活化的巨噬细胞综合基因表达信息 ,并筛选出一些新的可能与LPS活化相关的基因。

关键词：小鼠腹腔巨噬细胞 LPS 基因表达谱脂多糖刺激差异表达基因诱导信号调节蛋白转录因子 cDNA芯片

针刀治疗腰椎间盘突出症合并棘上、棘间韧带损伤25例

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中医杂志 2011年第19期52卷 1685-1686页

作者：李建辉李朝林刘巨超彭力亚刘鹏张孟军晋州市中医院.河北省晋州市朝阳街1号 052260

腰椎间盘突出症（LDH）中约80％患者可经非手术疗法缓解。三法一练协同治疗LDH疗法，方法简便，疗效显著而持久，复发率低。将2007年3月至2010年12月共收集到50例LDH合并棘上、棘间韧带损伤患者，随机分为对照组、治疗组，采用对照治疗... 详细信息

腰椎间盘突出症（LDH）中约80％患者可经非手术疗法缓解。三法一练协同治疗LDH疗法，方法简便，疗效显著而持久，复发率低。将2007年3月至2010年12月共收集到50例LDH合并棘上、棘间韧带损伤患者，随机分为对照组、治疗组，采用对照治疗，报告如下。

关键词：腰椎间盘突出症针刀疗法韧带损伤

Protective effects of lidocaine injected into the hepatoduodenal ligament on warm ischemia-reperfusion injury to the rat liver

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Chinese Medical Journal 2004年第2期17卷 275-279页

作者：陈明易李崇辉黄志强刘巨超周宁新黄晓强王燕生 Department of Hepatobiliary Surgery General Surgical Research Institute Chinese People' s Liberation Army General Hospital Beijing 100853 China

Background Ischemia-reperfusion (IR) injury to the liver is still a critical and daunting problem in the field of hepatobiliary surgery. Ischemic preconditioning (IP) of the liver serves as an effective approach against IR injury. This study was to develop a novel procedure that could mimic IP, but might be more feasible than IP during surgery.Methods Eighty-two SD rats were randomly divided into 5 groups. L group (n = 21 ): 0. 4% lidocaine (10 mg/kg) was injected into the hepatoduodenal ligament 10 minutes before a 40-minute hepatic IR. IP group (n =16): a 5-minute ischemia was followed by a 10-minute reperfusion prior to a 40-minute hepatic IR. ILR group (n =15): after a 40-minute ischemia of the liver, 0.4% lidocaine (10 mg/kg) was injected into the hepatoduodenal ligament 10 minutes prior to a 40-minute reperfusion of the liver. IR group (n =15): the liver of the rat was subjected to a 40-minute IR. Control group (n = 15): 0. 9% sodium chloride was injected into the hepatoduodenal ligament without other treatments. The levels of plasma alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST) were determined for each group after treatment.Results The mean concentrations of ALT and AST were (379. 80 ±141. 69) U/L and (606. 05 ± 220. 26) U/L for the L group, (334. 64 ±141. 94) U/L and (625. 68 ±267. 06) U/L for the IP group, (523. 36 ±170. 35) U/L and (765. 47 ±238. 45) U/L for the ILP group, (524. 29 ±163. 59) U/L and (764. 63 ±246. 79) U/L for the IR group, and (150. 90 ±27. 05) U/L and (298. 15 ±47. 68) U/L for the control group (standard error of the mean).Conclusion A significant decrease in ALT and AST levels was observed in the L and IP groups when compared to the ILR and IR groups (P0. 05). These results suggest that pretreatment with lidocaine injected into the hepatoduodenal ligament prior to IR provide

关键词： liver ischemic preconditioning ischemia-reperfusion injury lidocaine inneruation

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一种改良小鼠脓毒症模型的建立

中华实验外科杂志 2008年第4期25卷 510-512页

作者：郭振华李力刘巨超张兰徐迎新解放军总医院普通外科研究所北京100853

目的建立一种模拟外科临床实际，早期致死率低，用于脓毒症综合治疗研究的小鼠模型。方法小鼠随机分为3组，即对照组、盲肠结扎穿孔（CLP）组和改良组。对照组行假手术；CLP组行盲肠结扎穿孔术；改良组通过CLP后8h行盲肠切除和腹腔生理... 详细信息

目的建立一种模拟外科临床实际，早期致死率低，用于脓毒症综合治疗研究的小鼠模型。方法小鼠随机分为3组，即对照组、盲肠结扎穿孔（CLP）组和改良组。对照组行假手术；CLP组行盲肠结扎穿孔术；改良组通过CLP后8h行盲肠切除和腹腔生理盐水冲洗建立脓毒症模型。观察各组动物出现死亡时间及24、48、72h累计死亡率；术后4、12、24h分别处死动物，检测外周血白细胞计数（WBC），血清内毒素、肿瘤坏死因子（TNF）水平及肺、肝病理。结果改良组动物出现死亡时间较CLP组明显延迟，术后48、72h累计死亡率虽明显低于CLP组（P〈0．05），但仍分别高达53．3％、80％；术后各时间点WBC较CLP组与假手术组明显升高（P〈0．05）；血清内毒素和TNF-α水平明显高于假手术组，但低于CLP组；光镜下见肺泡间隔增宽，间质充血、水肿、大量炎性细胞浸润，肝细胞水肿伴散在点状坏死，肝窦扩张伴间质大量炎性细胞浸润。结论该脓毒症改良模型具有良好的外科临床相关性，早期致死率低，可重复性好。

关键词：脓毒症模型,动物小鼠

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综合治疗神经根型颈椎病72例

中国骨伤 2000年第9期13卷 563-564页

作者：秦同来刘巨超晋州市中医院河北晋州052260

我科采用颌枕牵引、手法按摩、神经阻滞及中药等方法综合治疗神经根型颈椎病,获得良好疗效.现将资料完整的72例总结报告如下.

关键词：综合治疗神经根型颈椎病牵引手法按摩

双特异性单链抗体介导的CIK细胞对结肠癌的体内杀伤作用

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中华实验外科杂志 2011年第8期28卷 1342-1343页

作者：刘洪一李荣刘巨超李力梁文涛徐迎新解放军总医院肿瘤外科北京100853 解放军总医院普通研究所北京100853

目的观察双特异性单链抗体介导的细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞在体内杀伤结肠癌细胞的作用。方法将SWlll6细胞种植裸鼠后，建立裸鼠结肠癌模型，分为3组分别经尾静脉注入生理盐水、CIK细胞及CIK细胞＋双特异性抗体，每周治疗1次，... 详细信息

目的观察双特异性单链抗体介导的细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞在体内杀伤结肠癌细胞的作用。方法将SWlll6细胞种植裸鼠后，建立裸鼠结肠癌模型，分为3组分别经尾静脉注入生理盐水、CIK细胞及CIK细胞＋双特异性抗体，每周治疗1次，共4周，取出肿瘤组织称重，并计算出各组的抑瘤率。结果在体内，CIK组和CIK＋双抗组均可抑制肿瘤生长，抑瘤率分别为29．70％和65．02％，与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。CIK组和CIK＋双抗组的瘤体积、瘤重、抑瘤率比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论CIK细胞本身可以抑制肿瘤细胞的生长，在加入抗CD3抗癌胚抗原（CEA）双特异性单链抗体后抑瘤作用明显增强。

关键词：结肠癌 CIK细胞双特异性单链抗体

骨髓基质干细胞／胶原凝胶复合物原位构建工程化肝组织

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中华实验外科杂志 2008年第2期25卷 168-170,F0004页

作者：赵云山张博峰吴欣刘巨超张兰李力李荣徐迎新解放军总医院普外研究所北京100853

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）与胶原凝胶材料复合后原位植入肝内的组织再生潜能。方法将来源于雄性SD大鼠的BMSCs与液态鼠尾胶原复合后，原位植入雌性大鼠肝组织挖除部位，分别于植入后1、2周取材。采用苏木素-伊红（HE）染色... 详细信息

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）与胶原凝胶材料复合后原位植入肝内的组织再生潜能。方法将来源于雄性SD大鼠的BMSCs与液态鼠尾胶原复合后，原位植入雌性大鼠肝组织挖除部位，分别于植入后1、2周取材。采用苏木素-伊红（HE）染色对植入部位组织学特征进行观察，并采用免疫组化染色和FISH方法分别对白蛋白、CK19及SRY基因进行检测。结果BMSCs与胶原凝胶复合后，细胞均匀的分布在整个BMSCs／胶原复合物中。体内植入后1周，观察到植入细胞分化出圆形、多角形等细胞形态。植入后两周，组织学显示植入部位形成肝细胞样的细胞集落，免疫组化染色显示这些细胞抗白蛋白抗体染色（Alb）阳性。此外，植入部位还形成由上皮样细胞围成的管状结构，抗CK19抗体染色提示这些上皮样细胞为胆管上皮细胞。原位杂交证实植入部位细胞主要来自植入的雄性大鼠的骨髓基质干细胞。结论BMSCs与胶原复合后原位植入肝内可形成类肝样组织。该方法经进一步研究有望用于肝脏病损的修复治疗。

关键词：骨髓基质干细胞胶原凝胶原位植入