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miR-7-5p通过调控Raf-1对HCT116细胞功能的影响

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miR-7-5p通过调控Raf-1对HCT116细胞功能的影响

作者：余杉杉昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]结直肠癌是全球第二大癌症死亡原因。这种高死亡率与其发生转移密切相关。随着对转移性结直肠癌（Metastatic colorectal cancer,mCRC）分子生物学的更深入的了解以及抗血管内皮生长因子（VEGF）和抗表皮生长因子受体（EGFR）药... 详细信息

[目的]结直肠癌是全球第二大癌症死亡原因。这种高死亡率与其发生转移密切相关。随着对转移性结直肠癌（Metastatic colorectal cancer,mCRC）分子生物学的更深入的了解以及抗血管内皮生长因子（VEGF）和抗表皮生长因子受体（EGFR）药物的出现,结直肠癌患者的治疗得以明显丰富,但所取得的疗效仍不尽如人意,部分患者甚至出现了耐药现象。并且在大约一半mCRC患者中发现存在RAS突变,而RAS突变正是抗EGFR治疗耐药的主要原因,因此急需寻找一种可以克服RAS突变的治疗方法,以改善结直肠癌患者的治疗现状。本课题组前期研究发现miRNA-7-5p在结直肠腺瘤癌变过程中发挥重要作用,证明了其在结直肠癌的诊断和治疗中的潜在价值,并且通过靶基因预测软件发现Raf-1是miR-7-5p潜在靶基因之一,而Raf-1是EGFR下游Ras-Raf-MEK-ERK信号转导途径中的重要成员,如果证实miR-7-5p能够调控Raf-1的表达进而影响细胞功能,则有望为RAS突变结直肠癌的治疗方面的研究提供新的思路。因此本研究通过在RAS突变的结直肠癌细胞株HCT116（KRAS G13D突变）中观察miRNA-7-5p对Raf-1的调控作用及对其细胞功能的影响,以期进一步探索miRNA-7-5p在RAS突变结直肠癌治疗中的潜在价值。[方法]1、应用分子生物学预测软件预测miRNA-7-5p与RAF-1的靶向结合位点。2、在 HCT116 细胞中构建空白对照、miR-7-5p mimics、miR-7-5pmimics-NC,miR-7-5p inhibitors、miR-7-5p inhibitors-NC 共 5 组,检测 miR-7-5p 表达量确保质粒转染模型构建成功,利用Western blot技术检测各组中Raf-1的表达量,观察miR-7-5p对Raf-1的表达量的影响,利用Spearman相关性分析探索两者之间是否存在相关性。3、构建 miR-7-5p inhibitors+GW5074（Raf-1 抑制剂）组,与 miR-7-5p inhibitor组相比较,观察加入Raf-1抑制剂后Raf-1的表达情况。4、通过克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验,以及流式细胞术,观察miRNA-7-5p对HCT116细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等细胞功能的影响,以及对细胞周期的影响。5、比较 miR-7-5p inhibitors 和 miR-7-5p inhibitors+GW5074 两组细胞中细胞功能的变化,观察Raf-1抑制剂对miRNA-7-5p低表达的挽救作用。[结果]1、应用分子生物学预测软件预测miR-7-5p与RAF-1存在两个结合位点;2、miR-7-5p表达水平比较;RT-qPCR检测结果显示,miR-7-5p mimics组细胞中miR-7-5p的表达水平较miR-7-5p mimics-NC组明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.001）;而 miR-7-5p inhibitors 组的表达水平较 miR-7-5p inhibitors-NC 组明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）;在 miR-7-5p inhibitors+GW5074（Raf-1 抑制剂）组中发现其miR-7-5p表达量与miR-7-5p inhibitors组相比无明显差异,不具有统计学意义（P＞0.05）;3、Raf-1的表达水平比较:Western blot检测结果显示,miR-7-5p mimics组与miR-7-5p mimic-NC组相比,Raf-1表达量明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）;而 miR-7-5p inhibitors 组与 miR-7-5p inhibitors-NC 组相比,Raf-1 表达量明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）;而miR-7-5p inhibitors+GW5074组与miR-7-5p inhibitors组相比Raf-1表达量明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）;4、在HCT116细胞中,miR-7-5p与Raf-1表达量存在负相关关系（r=-0.915,P＜0.01）;5、miR-7-5p及Raf-1对HCT116细胞功能的影响:1)细胞划痕实验:miR-7-5p mimics组与miR-7-5p mimics-NC组相比细胞迁移率明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）,而 miR-7-5p inhibitors 组与 miR-7-5p inhibitors-NC 组相比细胞迁移率明显明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.001）,miR-7-5p inhibitors+GW5074组与miR-7-5p inhibitors组相比

关键词： RAS突变结直肠癌 MicroRNA-7-5p Raf-1 靶向治疗

野生型和功能增强型ADAMTS13蛋白酶分子的表达及功能鉴定

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中国组织工程研究 2019年第3期23卷 441-446页

作者：余杉杉林蒋国方颖华南理工大学生物科学与工程学院广东省广州市510006

背景:血管性血友病因子水解蛋白酶13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1motif,member 13,ADAMTS13)可结合并酶切血管性血友病因子,在防止血小板过多聚集和血栓的形成中起到关键作用。重组ADAMTS13通常选择在真核细胞中表达分泌,然而对于其表达纯化目前仍缺乏一个明确高效的途径。目的:寻找合适的宿主细胞,得到稳定表达野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的细胞株,建立高纯度ADAMTS13的纯化方法,进而研究其生物学功能。方法:以野生型ADAMTS13重组质粒为模板,利用位点突变试剂盒得到功能增强型ADAMTS13重组质粒。比较CHO-S细胞、CHO-K1细胞、293T细胞对ADAMTS13的表达效果,挑选出合适的宿主细胞。通过Ni柱亲和层析和分子筛纯化蛋白;采用7.5%SDS-PAGE、Western-blot鉴定野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的纯度及特异性;利用原子力显微镜技术检测野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的相互作用,鉴定两种蛋白的活性。结果与结论:相对于CHO-S和CHO-K1,293T细胞更适合作为野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的表达宿主;经Ni柱亲和层析和分子筛纯化后,所得到的野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13质量浓度分别为103.7,149.7 mg/L,且两种蛋白纯度均约90%;原子力显微镜检测结果显示,野生型ADAMTS13、功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的黏附频率分别为11.37%,14.70%,表明功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的结合亲和力更高,这与近期ADAMTS13构象研究一致。

关键词：血管性血友病因子野生型ADAMTS13 功能增强型ADAMTS13 血管性血友病因子A2 宿主细胞位点突变真核表达原子力显微镜生物学功能国家自然科学基金金属蛋白酶类显微镜检查,原子力组织工程

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MicroRNA-21在结直肠腺瘤癌变中的研究进展

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实用癌症杂志 2022年第6期37卷 1042-1044页

作者：余杉杉(综述) 南琼(审校) 昆明医科大学第一附属医院 650032

临床上绝大多数结直肠癌患者被诊断为腺癌,由腺瘤发展而来,其诊断主要依赖结肠镜,但因其存在侵入性、费用问题等局限性难以广泛开展。因此寻找识别腺瘤-癌序列演变危险程度的无创生物标志物,筛查无症状可疑患者,对结直肠癌预防具有重要... 详细信息

临床上绝大多数结直肠癌患者被诊断为腺癌,由腺瘤发展而来,其诊断主要依赖结肠镜,但因其存在侵入性、费用问题等局限性难以广泛开展。因此寻找识别腺瘤-癌序列演变危险程度的无创生物标志物,筛查无症状可疑患者,对结直肠癌预防具有重要价值。MiRNAs是具有高度保守序列的内源性非编码单链RNA分子,由于其结构短,易于降解,在改善不同类型肿瘤的管理和早期检测方面显示出巨大前景^([1]),其中miR-21是潜在癌基因。

关键词： MicroRNA-21 腺瘤结直肠癌诊断

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原子力显微镜扫描揭示二价金属离子调控金属蛋白酶ADAMTS13构象

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原子力显微镜扫描揭示二价金属离子调控金属蛋白酶ADAMTS13构象

金属蛋白酶ADAMTS13的构象多态性及其识别VWF-A2的反应动力学

第十二届全国生物力学学术会议暨第十四届全国生物流变学学术会议

作者：余杉杉刘望林蒋国华南理工大学

目的探明哪种二价金属离子调控ADAMTS13的构象,以及二价金属离子如何影响ADAMTS13构象的力学稳定性。方法利用AFM对加入二价离子前后的ADAMTS13分子进行扫描,分析比较AFM图像中每个蛋白颗粒体积、投影面积、最长径和纵横比。结果未作E...

目的探明哪种二价金属离子调控ADAMTS13的构象,以及二价金属离子如何影响ADAMTS13构象的力学稳定性。方法利用AFM对加入二价离子前后的ADAMTS13分子进行扫描,分析比较AFM图像中每个蛋白颗粒体积、投影面积、最长径和纵横比。结果未作EDTA预处理的WT-ADAMTS13的纵横比呈双峰分布,GOF-ADAMTS13的纵横比呈三峰分布。其中,第1个峰代表闭合态(stateⅠ),第2个峰代表中间态(stateⅡ),第3个峰代表伸展态(stateⅢ)。EDTA预处理后,WT-/GOF-ADAMTS13均呈现三峰。加入5 mM Ca,WT-ADATS13的

关键词：

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金属蛋白酶ADAMTS13的构象多态性及其识别VWF-A2的反应动力学

ADAMTS13构象及其识别水解VWF的力学调控机制

第十二届全国生物力学学术会议暨第十四届全国生物流变学学术会议

作者：余杉杉刘望方金花石晓钟吴建华方颖林蒋国华南理工大学

目的探明野生型及突变体ADAMTS13分子的构象状态;阐明不同构象的ADAMTS13分子识别VWF-A2的力学调控机制。方法采用原子力显微镜技术,一方面对WT-和GOF-ADAMTS13分子进行扫描,分析分子的体积、投影面积、最长径以及纵横比;另一方面测量A...

目的探明野生型及突变体ADAMTS13分子的构象状态;阐明不同构象的ADAMTS13分子识别VWF-A2的力学调控机制。方法采用原子力显微镜技术,一方面对WT-和GOF-ADAMTS13分子进行扫描,分析分子的体积、投影面积、最长径以及纵横比;另一方面测量ADAMTS13与VWF-A2间分子键的断裂力及分子键寿命。结果 WT-ADAMTS13的构象呈双态分布(stateⅠ和Ⅱ);GOF-ADAMTS13呈三态分布(stateⅠ、Ⅱ和Ⅲ)。其中stateⅠ为闭合构象,stateⅢ为打开构象,而stateⅡ为中间态。此外,低pH使得WT-ADAMTS13的stateⅡ,GOF-AD-

关键词：

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ADAMTS13构象及其识别水解VWF的力学调控机制

大肠癌患者术前M分期与其临床特征及预后关系的研究

中国力学大会（CCTAM2019）

作者：方翔丁晓茹余杉杉刘望方金花方颖林蒋国吴建华华南理工大学生物科学与工程学院/生物力学研究所

金属蛋白酶ADAMTS13特异性地酶切血管性血友病因子VWF的A2结构域,下调VWF的黏附活性,减少血小板在血管受损处的黏附,进而防止血栓的形成。由自免疫抗体或基因突变引起的ADAMTS13功能不足,会导致威胁生命的血栓性血小板减少性紫癜(TTP)...

金属蛋白酶ADAMTS13特异性地酶切血管性血友病因子VWF的A2结构域,下调VWF的黏附活性,减少血小板在血管受损处的黏附,进而防止血栓的形成。由自免疫抗体或基因突变引起的ADAMTS13功能不足,会导致威胁生命的血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的形成。ADAMTS13识别、水解VWF受到血流剪应力的调控。此前,我们及其他研究者已经证明,外力导致的VWF-A2结构域的解折叠,是VWF水解的必要条件。然而,

关键词：

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肿瘤代谢与营养电子杂志 2021年第2期8卷 153-156页

作者：陈紫红刘红刘俊余杉杉刘贤敏南琼昆明医科大学第一附属医院消化内科昆明650032 昆明医科大学第一附属医院全科医学科昆明650032 昆明医科大学第一附属医院皮肤科昆明650032

目的探讨术前M分期与大肠癌患者临床特征及预后的关系,为大肠癌的预防及临床治疗提供理论依据。方法本文采用回顾性队列研究的科研设计,回顾性选取2011年8月至2014年8月在昆明医科大学第一附属医院经手术治疗且病理证实为大肠癌的患者,... 详细信息

目的探讨术前M分期与大肠癌患者临床特征及预后的关系,为大肠癌的预防及临床治疗提供理论依据。方法本文采用回顾性队列研究的科研设计,回顾性选取2011年8月至2014年8月在昆明医科大学第一附属医院经手术治疗且病理证实为大肠癌的患者,收集患者的临床资料并对其进行随访,至患者死亡、失访或最后一次随访时间为终点,截止时间为2019年8月31日。结果纳入随访147例,按TNM分期分为两组,其中M0期组106例、M1期组41例,与M0期组比较,M1期组合并胆道病史、合并阑尾病史、肝转移的比例均较高(均P<0.05);两组的发病年龄段构成不同,M0期组60~79岁、80~99岁占多数,M1期组20~39岁、40~59岁占多数。结论作为大肠癌患者的独立预后因素,术前M分期可作为预测大肠癌患者预后的重要指标,而胆道病史、阑尾病史、肝转移与大肠癌患者术后预后情况相关。

关键词：大肠癌预后多因素分析

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三明市沙县区社保中心全力推进“两类人员”个人账户清退工作

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就业与保障 2023年第7期 10-10页

作者：余杉杉明市沙县区人社局

为守护好社保基金安全，保障参保人员合法权益，三明市沙县区社保中心切实践行以人民为中心的发展思想，全力推进“两类人员”（已达到退休年龄一年以上和已死亡一年以上参保人员）个人账户清退工作。一是强化担当，为民服务。三明市沙...

为守护好社保基金安全，保障参保人员合法权益，三明市沙县区社保中心切实践行以人民为中心的发展思想，全力推进“两类人员”（已达到退休年龄一年以上和已死亡一年以上参保人员）个人账户清退工作。一是强化担当，为民服务。三明市沙县区社保中心高度重视“两类人员”个人账户清退工作，成立工作专班，由中心负责人牵头部署，认真督办，确保清退工作有突破、有成效。

关键词：

青年失业者的生命体验与生活选择——一个社会时间的视角

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中国青年研究 2025年

作者：余澍西北农林科技大学人文社会发展学院

作为生命历程中非意图的损害性事件，失业的发生打破了青年人遵照社会时间运行的行为模式与行动节奏，在干扰个体日常生活的同时亦使其生命历程陷入了停滞与中断。对于青年而言，这种停滞表现为生命历程规划的失序、生命历程运行的去同... 详细信息

作为生命历程中非意图的损害性事件，失业的发生打破了青年人遵照社会时间运行的行为模式与行动节奏，在干扰个体日常生活的同时亦使其生命历程陷入了停滞与中断。对于青年而言，这种停滞表现为生命历程规划的失序、生命历程运行的去同步化与生命历程时序性的断裂。在面对危机时，青年失业者通过适应、调整、复归与转向等策略试图恢复自身生命历程与社会时间的秩序性。当下，有必要重新审视我国的失业保障制度，以更加完善的失业保障制度嵌入于青年失业者重建生命历程与时间秩序的实践中，增强国家与社会对青年失业者的支持。

关键词：青年问题青年失业社会时间生命历程